綿羊BPI基因的克隆、表達及活性檢測.pdf

1、殺菌性/通透性增強蛋白(bactericidal/permeability iNcreasiNg proteiN,BPI)是存在于人和哺乳動物多形核粒細胞內(nèi)的一種陽離子抗菌蛋白,在中性粒細胞的諸多抗菌成分中,BPI蛋白是目前發(fā)現(xiàn)的唯一能夠非特異性殺傷革蘭氏陰性菌并中和內(nèi)毒素,同時具有免疫調(diào)節(jié)等作用的抗菌物質(zhì)。本研究以新疆巴什拜羊及其雜交羊為研究對象,應用分子生物學技術克隆BPI基因全長cDNA序列,并進行序列分析,表達并純化BPI蛋白,

2、并而后通過抑菌試驗驗證其生物學活性。
　　目的:本研究通過克隆巴什拜羊及其雜交羊的 BPI基因 cDNA全長序列,對其進行生物信息學分析,通過原核表達巴什拜羊及其雜交羊BPI基因,研究重組BPI蛋白對革蘭氏陰性菌的抑菌作用,驗證其生物活性,為下一步研究綿羊BPI蛋白的生物學功能奠定基礎。
　　方法:(1)巴什拜羊及其雜交羊 BPI基因全長 cDNA的擴增及序列分析:根據(jù) NCBI已報道的牛BPI基因序列,設計兼并引物,克隆獲

3、得巴什拜羊及其雜交羊BPI基因片段,通過該片段設計RACE引物,應用RACE技術分別擴增以上兩種羊BPI基因的全長cDNA序列,并測序、拼接,最后利用生物學軟件對所得 BPI全長 cDNA序列進行分析。
　　(2)巴什拜羊及雜交羊 BPI基因全長cDNA的生物信息學分析:利用在線分析工具對獲得的 BPI基因序列進行基因結構及理化特性分析,并預測其功能;運用網(wǎng)絡數(shù)據(jù)庫及程序,對 BPI蛋白進行生物信息學分析。
　　(3)巴什拜

4、羊及雜交羊 BPI基因 N-端序列的擴增:采集巴什拜羊及雜交羊外周血液,分離中性粒細胞并提取RNA,根據(jù)RACE技術得到的BPI cDNA序列設計特異性PCR引物,分別克隆出巴什拜羊及其雜交羊BPI基因N-端序列,回收PCR產(chǎn)物與pMD18-T載體連接后轉(zhuǎn)化感受態(tài)細胞DH5α,檢測陽性克隆、測序。
　　(4)巴什拜羊及雜交羊 BPI基因表達載體的構建及表達:將鑒定正確的巴什拜羊和雜交羊BPI N-端序列連接至pGEX原核表達載體,

5、構建pGEX-BPI表達質(zhì)粒,轉(zhuǎn)化至感受態(tài)細胞BL21(DE3)中,優(yōu)化誘導表達條件并進行 SDS-PAGE分析鑒定。
　　(5)巴什拜羊及雜交羊 BPI蛋白的純化及其生物學活性檢測:利用 GST樹脂純化方法分別對巴什拜羊及雜交羊重組 BPI蛋白進行純化,SDS-PAGE檢測。分別用微量肉湯稀釋法和瓊脂糖抑菌試驗分別檢測兩種羊重組BPI蛋白的生物學活性。
　　結果與結論:(1)巴什拜羊BPI基因cDNA序列全長為1922bp

6、,其中開放閱讀框1452bp,共編碼483個氨基酸,編碼區(qū)兩側翼分別具有5′-UTR54 bp和3′-UTR416 bp。BLAST結果表明巴什拜羊 BPI與綿羊(預測)、牛、虎鯨、野豬、獼猴、人、家兔、小鼠、非洲爪蟾的核苷酸同源性分別為99％、91%、78%、74%、64%、61%、58%、53%、50%。雜交羊BPI基因cDNA序列全長為1939bp,其中開放閱讀框1452bp,共編碼483個氨基酸,編碼區(qū)兩側翼分別具有5′-UTR

7、84bp和3′-UTR403bp。BLAST結果表明雜交羊BPI與綿羊(預測)、牛、虎鯨、野豬、獼猴、人、家兔、小鼠、非洲爪蟾的核苷酸同源性分別為97%、91%、77%、74%、64%、60%、58%、52%、50%。比較巴什拜羊與雜交羊 BPI開放閱讀框后發(fā)現(xiàn),有11處堿基改變,其中6處堿基的改變使得其編碼氨基酸產(chǎn)生差異。
　　(2)巴什拜羊BPI基因ORF中(A+T)含量為45.25%[657],(C+G)含量為4.75%[7

8、95];其雜交羊BPI基因ORF中(A+T)含量為44.97%[653],(C+G)含量為55.03%[799]。兩種羊的 BPI蛋白均為親水性蛋白,屬于分泌蛋白,主要存在于細胞外基質(zhì);巴什拜羊 BPI蛋白含有19個α螺旋,18個β折疊,33個轉(zhuǎn)角和無規(guī)則卷曲,而雜交羊BPI蛋白含有18個α螺旋。N端均有信號肽,有 BPI1和 BPI2兩個保守結構域。通過分子進化樹研究發(fā)現(xiàn)巴什拜羊/雜交羊的 BPI基因在綿羊、牛、虎鯨、野豬、人、獼猴、

9、家兔、小鼠、非洲爪蟾中,與綿羊首先聚為一類,后與牛聚為一類,這與動物分類學一致。
　　(3)巴什拜羊及其雜交羊 BPI基因 N-端序列均為598bp,編碼198個氨基酸。經(jīng)比較兩種羊N-端序列序列,發(fā)現(xiàn)兩者之間共有3處核苷酸差異,雜交羊編碼序列第328位,處于密碼子第一位的 G變?yōu)?T,導致了氨基酸 Gly(甘氨酸)轉(zhuǎn)變?yōu)?Cys(半胱氨酸);第449位,處于密碼子第二位的 T變?yōu)?G,導致了氨基酸 Val(纈氨酸)轉(zhuǎn)變?yōu)?Gly

10、(甘氨酸);第660位,處于密碼子第二位的 A變?yōu)?G,導致了氨基酸 GlN(谷氨酰胺)轉(zhuǎn)變?yōu)?Arg(精氨酸)。
　　(4)成功構建了巴什拜羊及其雜交羊 BPI原核表達載體,并在大腸桿菌中進行表達,宿主菌表達出分子量約為45KD的融合蛋白。
　　(5)表達產(chǎn)物純化后,經(jīng) SDS-PAGE檢測顯示,觀察到條帶單一的目的條帶,成功純化了巴什拜羊及其雜交羊重組 BPI蛋白。微量肉湯稀釋法結果表明隨著蛋白濃度的增大,對大腸桿菌的作