綿羊SPLUNC1基因的克隆、表達(dá)及活性檢測(cè).pdf

1、綿羊支原體肺炎是一種能引發(fā)綿羊以咳嗽、喘氣、漸進(jìn)性消瘦及肺間質(zhì)的增生性炎癥為特征的慢性呼吸道疾病，對(duì)養(yǎng)羊業(yè)危害嚴(yán)重。短的上腭、肺及鼻咽上皮克隆基因1（short palate，lung and nasal epithelium clone1，SPLUNC1）是一種在呼吸道上皮高表達(dá)的蛋白質(zhì)分子，參與了宿主防御活動(dòng)，具有抗菌和抗炎的功能，同時(shí)還能抑制肺炎支原體生長(zhǎng)。本研究通過克隆巴什拜羊與湖羊的SPLUNC1基因cDNA全長(zhǎng)序列，對(duì)其進(jìn)行

2、生物信息學(xué)分析，通過真核表達(dá)巴什拜羊與湖羊的SPLUNC1基因，研究重組SPLUNC1蛋白對(duì)綿羊肺炎支原體的作用，驗(yàn)證其生物活性，為下一步研究綿羊SPLUNC1蛋白的生物學(xué)功能奠定基礎(chǔ)。
　　本研究主要內(nèi)容包括：⑴巴什拜羊與湖羊的SPLUNC1基因全長(zhǎng)cDNA的擴(kuò)增：根據(jù)GenBank上已報(bào)道的牛的SPLUNC1基因序列，設(shè)計(jì)引物，使用RACE技術(shù)分別克隆巴什拜羊與湖羊的SPLUNC1基因的3’端序列和5’端序列，并測(cè)序、拼接獲得

3、巴什拜羊與湖羊的SPLUNC1基因的全長(zhǎng)cDNA序列。⑵巴什拜羊與湖羊的SPLUNC1基因全長(zhǎng)cDNA的生物信息學(xué)分析：利用生物信息學(xué)軟件及在線分析工具對(duì)獲得的巴什拜羊與湖羊SPLUNC1基因全長(zhǎng)cDNA序列進(jìn)行核酸及其編碼蛋白信號(hào)肽、亞細(xì)胞定位、二級(jí)結(jié)構(gòu)、三級(jí)結(jié)構(gòu)、進(jìn)化樹等生物信息學(xué)分析。⑶巴什拜羊與湖羊的SPLUNC1基因的克隆與表達(dá)：使用PCR方法擴(kuò)增出巴什拜羊與湖羊的SPLUNC1基因的開放閱讀框序列，并將該序列連接至pPIC9

4、K真核表達(dá)載體，構(gòu)建pPIC9K-SPLUNC1表達(dá)質(zhì)粒，轉(zhuǎn)化至巴斯德畢赤酵母GS115感受態(tài)細(xì)胞中進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，優(yōu)化誘導(dǎo)表達(dá)條件并對(duì)表達(dá)產(chǎn)物進(jìn)行 SDS-PAGE和 Western Blotting分析鑒定。⑷重組巴什拜羊與湖羊的SPLUNC1蛋白的純化與生物活性研究：利用Ni柱純化方法分別對(duì)重組巴什拜羊與湖羊 SPLUNC1蛋白進(jìn)行純化，將純化的蛋白作用于綿羊肺炎支原體，使用熒光實(shí)時(shí)定量法檢測(cè)純化蛋白對(duì)綿羊肺炎支原體的作用。⑸巴什拜

5、羊、湖羊SPLUNC1基因全長(zhǎng)分別為1095bp和1091bp，核苷酸相似性為99％。⑹巴什拜羊、湖羊SPLUNC1的核苷酸序列有五處核苷酸堿基差異，但是二者的開放閱讀框均為768bp，編碼氨基酸相同，均為255個(gè)氨基酸。SPLUNC1蛋白質(zhì)的分子量為26.53 KD，理論等電點(diǎn)為5.07。SPLUNC1蛋白N端存在信號(hào)肽，亞細(xì)胞定位在細(xì)胞外。SPLUNC1蛋白質(zhì)的二級(jí)結(jié)構(gòu)主要為α螺旋和無規(guī)則卷曲。該蛋白由4股反平行的肽段形成的β折疊片

6、和2個(gè)α螺旋組成的桶型結(jié)構(gòu)域組成。系統(tǒng)發(fā)育樹分析結(jié)果說明，SPLUNC1蛋白與山羊首先聚為一類，后與牛聚為一類，這與動(dòng)物學(xué)分類結(jié)果一致。⑺在巴斯德畢赤酵母 GS115中成功表達(dá)巴什拜羊與湖羊重組SPLUNC1蛋白，經(jīng)SDS-PAGE檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，蛋白的分子量均為25.53kD，且在甲醇誘導(dǎo)72h表達(dá)的蛋白含量較高，經(jīng)Western Blotting檢測(cè)證實(shí)表達(dá)蛋白為目的蛋白。⑻SDS-PAGE檢測(cè)純化的重組蛋白，結(jié)果顯示為單一的條帶，且分子