綿羊痘病毒甘肅株的分離鑒定和膜蛋白ORF23基因的克隆、表達(dá)及免疫活性分析.pdf

1、羊痘(Capripox)是由羊痘病毒屬的綿羊痘病毒(Sheeppox virus，SPV)或山羊痘病毒(Goatpox virus，GPV)引起的綿羊或山羊的一種急性、熱性、接觸性傳染病。本實(shí)驗(yàn)從甘肅景泰一羊痘疑似病例病料中分離到一株羊痘病毒，利用細(xì)胞培養(yǎng)、動物回歸試驗(yàn)及PCR方法對其進(jìn)行鑒定，克隆表達(dá)了EEV(enveloped extracellular virus，EEV)膜蛋白并對其進(jìn)行了免疫活性分析。取得了如下結(jié)果：

2、1.羊痘病毒的分離及PCR鑒定從所采集的病變組織中所分離的毒株能夠使綿羊睪丸原代細(xì)胞出現(xiàn)細(xì)胞病變，接種健康羊后引起體溫升高和在體表少毛或無毛區(qū)出現(xiàn)痘疹。從組織病料及細(xì)胞培養(yǎng)物中提取病毒DNA，利用PCR技術(shù)，克隆羊痘病毒糖蛋白ORF118基因，序列分析表明該基因在綿羊痘病毒各流行株之間高度保守，且有一個由N端的35個氨基酸組成的信號肽和一個由N端第21到38位的疏水氨基酸殘基構(gòu)成的跨膜區(qū)。 2.綿羊痘甘肅株膜蛋白ORF23基因的

3、原核表達(dá)及免疫活性分析將綿羊痘甘肅株膜蛋白ORF23基因插入原核表達(dá)載體pET-30a(+)中，經(jīng)PCR和酶切鑒定，證明成功構(gòu)建了重組表達(dá)載體pET-SPV23。經(jīng)IPTG誘導(dǎo)，該基因在大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)中以包涵體形式得到大量表達(dá)，表達(dá)蛋白分子量為43kDa。利用鎳金屬層析柱將表達(dá)產(chǎn)物進(jìn)行純化，獲得了理想的純化結(jié)果。利用'Western-blotting對純化后產(chǎn)物進(jìn)行分析，表達(dá)產(chǎn)物能夠被綿羊痘標(biāo)準(zhǔn)陽性血清識別，具有免疫反應(yīng)性。