PLP-I基因在小鼠睪丸中的表達(dá)定位及多克隆抗體制備.pdf

1、目的:
　　Prolactin-like protein I，簡稱PLP-I，又名PLP-J、Prlpj、Prlpi、prl3c1，與其他PRL基因家族成員不同，PLP-I是目前新發(fā)現(xiàn)的一種催乳素樣基因。據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，PLP-I主要在雌性胎盤蛻膜組織中有表達(dá)，在雄性無表達(dá)。本課題組發(fā)現(xiàn)，PLP-I在雄性睪丸中也有表達(dá)。因此本研究擬探索PLP-I在小鼠睪丸中的表達(dá)定位，并制備多克隆抗體及PLP-J上調(diào)表達(dá)慢病毒，為深入研究PLP-J基

2、因功能奠定基礎(chǔ)。
　　方法:
　　采用原位雜交、免疫組化及免疫熒光方法對PLP-I在小鼠睪丸中表達(dá)進(jìn)行定位，采用RT-PCR方法與Western Blotting方法檢測不同年齡段mRNA表達(dá)水平與蛋白表達(dá)水平。
　　設(shè)計(jì)多肽肽段序列，構(gòu)建原核表達(dá)載體PET30a-PLP-I，通過IPTG誘導(dǎo)，獲得純化抗原，免疫兔，獲得PLP-I抗體。
　　構(gòu)建慢病毒過表達(dá)載體，制備和包裝PLP-I過表達(dá)慢病毒，轉(zhuǎn)染TM3睪丸L

3、edig細(xì)胞，篩選穩(wěn)定細(xì)胞株，采用RT-PCR及WB分別檢測PLP-I基因過表達(dá)后的mRNA及蛋白表達(dá)水平。采用流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞周期改變情況。
　　結(jié)果:
　　1.RT-PCR以及WB結(jié)果顯示PLP-I在小鼠睪丸中有表達(dá)，且表達(dá)趨勢為成年組最高，18day組最低。
　　2.ISH及IHC法結(jié)果顯示PLP-I陽性表達(dá)于小鼠睪丸Ledig細(xì)胞，IF染色法結(jié)果顯示PLP-I在TM3 Ledig細(xì)胞的胞漿中表達(dá)。