大黃素對非酒精性脂肪肝肝臟單純肝脂肪變性改善作用及機制研究.pdf

1、背景：
　　 非酒精性脂肪肝(NonalcoholicFattyLiverDisease，NAFLD)作為一種慢性肝臟損害性疾病在很多國家普遍存在。非酒精性脂肪肝的整體發(fā)生率在西方國家達到15％-40%，在亞洲發(fā)生率為9%-40%，并且在過去的十五年迅速地增長。本病包括了一系列的疾病過程，從單純性脂肪肝，非酒精性脂肪性肝炎(Non-alcoholicsteatohepatitis，NASH)到肝纖維化，肝硬化，最終進展為肝細胞癌

2、。非酒精性脂肪肝的存在與心包脂肪增加，頸動脈狹窄，心血管死亡率增加有關，這就使本病的預后更加嚴重。該病已成為嚴重影響我國人民身心健康和國民經(jīng)濟、社會發(fā)展和穩(wěn)定的主要疾病之一。
　　 NAFLD病機不甚明了，大多數(shù)學者較為認可的有“二次打擊”學說，“初次打擊”主要為胰島素抵抗，各種病因所致NAFLD幾乎普遍存在胰島素抵抗現(xiàn)象。胰島素抵抗通過促使外周脂解增加和高胰島素血癥引起肝細胞脂肪儲積，并誘致對內(nèi)外性損害因子敏感性增高；二次打擊

3、主要為反應性氧化代謝產(chǎn)物增多，導致脂質(zhì)過氧化及其異常細胞因子的作用，進而引起壞死、甚至進展性肝纖維化。
　　 最近研究顯示，脂肪細胞分泌的細胞因子具有調(diào)節(jié)肝臟細胞脂質(zhì)代謝的作用，其中脂聯(lián)素成為研究熱點，而存在于肝臟細胞中的脂聯(lián)素受體2被認為NAFLD的發(fā)病機制有關。脂聯(lián)素與其結(jié)合后通過調(diào)控與肝臟脂質(zhì)氧化相關核轉(zhuǎn)錄因子PPAR-alpha及其控制的脂質(zhì)氧化限速酶來增加肝臟細胞脂質(zhì)氧化，從而減少肝臟脂質(zhì)沉積。目前世界范圍內(nèi)尚無療效確

4、切，安全穩(wěn)定的治療NAFLD的藥物，研發(fā)通過化學合成或從中草藥中尋找干預脂聯(lián)素受體2-PPAR-alpha信號途徑，增加肝臟脂質(zhì)氧化，達到治療目的藥物成為熱點。
　　 非酒精性脂肪肝屬中醫(yī)“肥胖”“脅痛”“黃疽”等病范疇。多由過食肥甘厚味，濕熱蘊藉中焦，濕熱阻滯，氣機受阻，氣血運行不暢，而疲血內(nèi)生。病理關鍵在“濕（痰）”“熱”，“瘀”。大黃素為中藥何首烏、大黃的主要活性成分之一，何首烏能補益肝腎，又能潤腸通便而泄?jié)幔簏S下瘀熱祛

5、濁瘀，于本病病機和主治最是合拍，自古為中醫(yī)家治療“肥胖”“脅痛”“黃疽”等病的要藥，而大黃素在降脂、保護肝細胞等方面有一定效果，作用于NAFLD關鍵病理因素。本實驗旨在用現(xiàn)代分子生物學手段系統(tǒng)觀察其療效，并深入探討其可能的作用靶點，為從中草藥中開發(fā)治療NAFLD藥物作探索性研究。
　　 目的：
　　 1．觀察大黃素對非酒精性脂肪肝早期體內(nèi)及體外模型的影響，包括對體質(zhì)量、肝質(zhì)量、肝細胞脂肪變、肝功能、血脂代謝的影響，肝細胞

6、株內(nèi)TG、肝酶等影響。
　　 2．研究大黃素治療非酒精性脂肪肝的可能作用機制，包括改善脂質(zhì)沉積、保護肝細胞、減輕氧化應激以及對脂聯(lián)素受體2、PPAR-alpha、CPT1、ACOX1的蛋白及基因表達的影響
　　 方法：
　　 C57BL6小鼠62只，正常喂養(yǎng)1周后隨機分為分為2組，空白組對照(A，13只)和模型組(M,49只)，組間大鼠體重差異無顯著性(P＞0.05)?？瞻讓φ战M給以普通飼料，其余各組均給以高脂飼

7、料。正常組給予標準飼料，模型組給予高脂飼料(88%標準飼料+10%豬油+2%膽固醇)喂養(yǎng)，自由飲水和進食，動物房保持安靜，自然采光，溫度25℃左右，喂養(yǎng)持續(xù)8周，分別從正常對照組和空白模型組隨機挑選一只，取肝臟做病理切片，證實非酒精性脂肪肝形成。再將模型組完全隨機法分為4組：模型組、大黃素組、人參皂苷組、羅格列酮組。8周后，空白對照組灌胃給以DMSO，（5%DMSO20mg/kg體重）、人參皂苷組灌胃給以人參皂苷(20mg/kg)、大黃

8、素組灌胃給以大黃素(20mg/kg)，羅格列酮組給予羅格列酮灌胃(10mg/kg)。
　　 治療4周，取小鼠血清及肝臟組織標本。測體質(zhì)量，稱肝質(zhì)量，計算肝指數(shù)，根據(jù)試劑盒說明測定血清谷丙轉(zhuǎn)氨酶、谷草轉(zhuǎn)氨酶、甘油三酷(TG)、膽固醇(TC)、低密度脂蛋白(LDL-C)、高密度脂蛋白(HDL-C)，游離脂肪酸(FFA)；對肝組織進行病理學檢查，HE染色觀察其脂肪變程度；蛋白免疫印跡法(westeoblotting)檢測脂聯(lián)素受體2、

9、PPAR-alpha、CPT1、ACOX1蛋白表達；實時熒光定量(real-timePCR)檢測脂聯(lián)素受體2、PPAR-alpha、CPT1、ACOX1基因表達。
　　 HepG2細胞，用1640培養(yǎng)基+10%FBS培養(yǎng)(37℃,5%CO2)。分組：設空白組、造模組、大黃素組、人參皂苷組、羅格列酮組。取對數(shù)生長期的HepG2細胞，每組設2個復孔，加入誘導液(油酸：棕櫚酸2∶1)誘導24h，分別加入大黃素、人參皂苷、羅格列酮，觀察

10、24h、48h、72h。油紅染色觀察細胞內(nèi)脂質(zhì)沉積，測定TG、肝酶含量，蛋白免疫印跡法(westeoblotting)檢測脂聯(lián)素受體2、PPAR-alpha.CPT1、ACOX1蛋白表達；實時熒光定量(real-timePCR)檢測脂聯(lián)素受體2、PPAR-alpha、CPT1、ACOX1基因表達。
　　 所有數(shù)值以均數(shù)±標準誤表示，用SPSS11.5軟件進行t檢驗或者方差分析(ANOVA)，當P＜0.05時，認為處理組和對照組之

11、間有顯著性差異。
　　 結(jié)果：
　　 第一部分，體內(nèi)實驗
　　 1．根據(jù)肝臟病理狀態(tài)，可見彌漫性肝細胞大泡樣脂肪變，無明顯炎癥、壞死及纖維化，NAFLD小鼠早期單純性肝脂肪變性階段模型復制成功。
　　 2．與模型組相比，大黃素可降低小鼠體質(zhì)量，但無明顯差異(P＞0.05)。降低肝臟質(zhì)量，肝指數(shù)(P＜0.05，P＞0.05)．肝臟病理顯示，大黃素可明顯改善肝臟脂肪沉積(P＜0.01)。肝細胞形態(tài)、排列均明顯

12、好轉(zhuǎn)。大黃素可明顯降低血清ALT、AST(P＜0.05)，明顯降低血清TG，F(xiàn)FA，CHO水平(P＜0.05)，降低血清LDL，升高HDL(P＞0.05)。大黃素可降低MDA水平(P＞0.05)，明顯升高SOD水平(P＜0.01)。
　　 3．大黃素能上調(diào)脂聯(lián)素受體2、PPAR-alpha、CPT1、ACOX1的蛋白及基因表達(P＜0.01)。
　　 第二部分，大黃素治療非酒精性脂肪肝體內(nèi)實驗
　　 1．誘導液誘

13、導HepG2細胞株24h后，油紅染色顯示細胞內(nèi)有大小不等的脂滴存在，且細胞活力及形態(tài)較好，表明NAFLD單純肝脂肪變性體外模型形成。
　　 2．大黃素可以改善細胞內(nèi)脂質(zhì)沉積、降低TG含量(P＜0.05)，降低ALT及AST含量，升高SOD含量(P＜0.01)。
　　 3．大黃素能上調(diào)HepG2細胞株造模后脂聯(lián)素受體2、PPAR-alpha、CPT1、ACOX1的蛋白及基因表達(P＜0.01)。
　　 結(jié)論：

14、>　　 通過上述大黃素對NAFLD體內(nèi)、體外藥效及其可能的作用機制初步研究得出一下結(jié)論：
　　 1．大黃素能減輕NAFLD大鼠體質(zhì)量，減輕肝臟腫大及肝臟濕質(zhì)量，改善肝細胞內(nèi)的脂質(zhì)沉積。顯示大黃素有一定的減肥作用，通過減輕內(nèi)臟脂肪堆積達到治療NAFLD。
　　 2．大黃素能降低小鼠血清肝酶及肝細胞釋放的肝酶，改善NAFLD單純性肝脂肪變性階段由脂質(zhì)沉積肝細胞導致的肝細胞受損。
　　 3．大黃素能減少血清FFA，降

15、低血清TG、TC、LDL-C，增加HDL-C，糾正血脂紊亂。可能機制是通過減少進入肝細胞游離脂肪酸，從而降低肝臟甘油三酷合成，減輕過量FFA的毒性作用，逆轉(zhuǎn)肝臟脂肪沉積，改善肝功能，保護肝細胞。
　　 4．大黃素能增強體內(nèi)抗氧化能力，減少活性氧及自由基的產(chǎn)生，抑制脂質(zhì)過氧化，減輕肝臟炎癥及脂肪肝進展。其機制可能是通過減少循環(huán)中血清FFA，減少肝細胞FFA的攝入，從而減輕線粒體氧化負荷，改善線粒體β氧化，減少活性氧及自由基的產(chǎn)生。