柞蠶核型多角體病毒兩個(gè)基因功能初探.pdf

1、我們以南陽(yáng)云陽(yáng)蠶廠的柞蠶為研究對(duì)象，首先從得膿病致死的柞蠶尸體中純化ApNPV的多角體，我們采用差速離心的方法，經(jīng)過幾輪洗滌離心后，得到了較為純凈的沉淀，即為ApNPV的多角體。在電子顯微鏡下觀察，ApNPV多角體多呈四角形。接著我們對(duì)ApNPV多角體進(jìn)行了切片并在透射電鏡下觀察，每個(gè)多角體中有多個(gè)核衣殼。然后采用傳統(tǒng)的方法，弱堿裂解上一步純化的ApNPV的多角體，經(jīng)過超速離心，得到了ApNPV的病毒粒子，電鏡下可以看到呈桿狀的病毒粒子

2、。 2006年，NCBI上公布了ApNPV全基因組序列，這為從基因水平研究ApNPV打下了基礎(chǔ)。經(jīng)過對(duì)全基因組序列分析，發(fā)現(xiàn)在ApNPV基因中沒有p35的同源基因，但是有兩個(gè)iap基因，iap1和iap2。由于并不是所有的iap基因都具有凋亡抑制的功能，因此，我們本研究的重點(diǎn)是探索ApNPV的兩個(gè)iap基因是否具有凋亡抑制的功能。第一步是得到這兩個(gè)基因，為此我們首先提取了ApNPV的基因組DNA，并以此為模板，以網(wǎng)上公布的序列設(shè)

3、計(jì)引物，擴(kuò)增了Ap-iap1和Ap-iap2，經(jīng)測(cè)序鑒定正確。接著將這兩個(gè)基因分別克隆到pIZT/V5-His載體上，這個(gè)載體具有IE2啟動(dòng)子。將同等量的構(gòu)建好的質(zhì)粒pIZT/V5-His-Apiap1、pIZT/V5-His-Apiap2分別轉(zhuǎn)染Sf21細(xì)胞，再用放線菌素D誘導(dǎo)調(diào)亡，結(jié)果發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染pIZT/V5-His-Apiap1的細(xì)胞沒有出現(xiàn)凋亡的現(xiàn)象，而轉(zhuǎn)染pIZT/V5-His-Apiap2質(zhì)粒的細(xì)胞都出現(xiàn)明顯的凋亡現(xiàn)象，DNA

4、 ladder和流式細(xì)胞儀分析也得到了同樣的結(jié)果。我們又做了標(biāo)記拯救試驗(yàn)，將重組質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)染Sf9細(xì)胞后，加入AcMNPV△p35/pol+病毒，結(jié)果發(fā)現(xiàn)pIZT/V5-His-Apiap1可以拯救AcMNPV△p35/pol+在細(xì)胞中的復(fù)制，形成清晰的病毒多角體，而pIZT/V5-His-Apiap2質(zhì)粒不能拯救AcMNPV△p35/pol+的復(fù)制。根據(jù)以上結(jié)果，可以說明ApNPV的Ap-iapl基因是個(gè)凋亡抑制基因，而Ap-iap2

5、則不具有凋亡抑制功能。 為了進(jìn)一步研究Ap-IAP1和IAP2的體外功能，需要大量表達(dá)蛋白。首先PCR擴(kuò)增出兩個(gè)基因，克隆到pET28b載體，用構(gòu)建好的載體轉(zhuǎn)化E.coli B121宿主菌，并用含有pET28b空載體的E.coli B121和沒有質(zhì)粒的E.coli Bl21作陰性對(duì)照。結(jié)果表明有重組質(zhì)粒的E.coli B121的泳道中，分別有31KD和21KD的蛋白帶，而在陰性對(duì)照的泳道中均沒有出現(xiàn)正這兩條帶。為了鑒定此蛋白，我