酒精對(duì)胎鼠腦新皮質(zhì)神經(jīng)干細(xì)胞自我更新和分化的影響研究.pdf

1、孕期飲酒可導(dǎo)致多器官系統(tǒng)生長(zhǎng)發(fā)育異常和生長(zhǎng)發(fā)育遲緩以及功能障礙,其中腦是酒精作用的最主要靶器官之一。以往臨床病例顯示孕期飲酒所導(dǎo)致的腦結(jié)構(gòu)和功能發(fā)育異常主要表現(xiàn)為神經(jīng)元的形態(tài)和功能發(fā)育異常,而神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞對(duì)神經(jīng)元具有營(yíng)養(yǎng)和支持作用,故研究多側(cè)重于酒精對(duì)神經(jīng)元和神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞的影響。
　　神經(jīng)干細(xì)胞的發(fā)現(xiàn)和分離培養(yǎng)為毒理學(xué)研究提供了有利工具。神經(jīng)干細(xì)胞具有自我更新和多向分化能力,通過(guò)自我更新補(bǔ)充干細(xì)胞庫(kù),通過(guò)多向分化能力產(chǎn)生神經(jīng)元和神

2、經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞。外源性化學(xué)物干擾神經(jīng)干細(xì)胞自我更新和分化將影響神經(jīng)系統(tǒng)的正常發(fā)育和功能。本課題從胎鼠腦皮質(zhì)分離純化神經(jīng)干細(xì)胞,研究酒精對(duì)神經(jīng)干細(xì)胞自我更新和分化的影響和可能機(jī)制,以期為探討其作用機(jī)制提供科學(xué)依據(jù)。
　　l.大鼠胚胎腦新皮質(zhì)神經(jīng)干細(xì)胞的體外分離培養(yǎng)方法研究本研究從孕14天SD大鼠胚胎腦分離新皮質(zhì),通過(guò)機(jī)械吹打改善細(xì)胞分散狀態(tài)、優(yōu)化無(wú)血清培養(yǎng)基條件,從而改進(jìn)神經(jīng)干細(xì)胞的培養(yǎng)方法。利用神經(jīng)干細(xì)胞標(biāo)志蛋白(nestin和SOX

3、2)、增殖和克隆成球能力以及多向分化能力測(cè)試三方面對(duì)神經(jīng)干細(xì)胞鑒定。以該法培養(yǎng)的神經(jīng)干細(xì)胞nestin蛋白呈強(qiáng)陽(yáng)性表達(dá),SOX2陽(yáng)性表達(dá)率達(dá)99％以上,BrdU摻入陽(yáng)性,培養(yǎng)3天后細(xì)胞量為接種量的10.55倍,6日克隆成球率為(33.00±4.40)％。經(jīng)相應(yīng)特異性標(biāo)志蛋白檢測(cè)證實(shí)神經(jīng)干細(xì)胞經(jīng)誘導(dǎo)分化后可形成神經(jīng)元(MAP2)、星形膠質(zhì)細(xì)胞(GFAP)和少突膠質(zhì)細(xì)胞(O4.)。本法獲得的神經(jīng)干細(xì)胞純度和細(xì)胞產(chǎn)出率高,具有強(qiáng)自我更新和多向

4、分化能力,可為毒理學(xué)研究提供良好的模型。
　　2.酒精對(duì)胎鼠腦新皮質(zhì)神經(jīng)干細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)的影響利用透射電鏡和掃描電鏡技術(shù)觀察神經(jīng)干細(xì)胞的超微結(jié)構(gòu)。神經(jīng)球結(jié)構(gòu)較松散,細(xì)胞主要為核質(zhì)比大的原始細(xì)胞。神經(jīng)球呈現(xiàn)異質(zhì)性,由電子密度高的暗細(xì)胞和電子密度低的明細(xì)胞組成?？捎^察到不同分裂時(shí)相的細(xì)胞。存在細(xì)胞凋亡,一些細(xì)胞吞噬功能旺盛。細(xì)胞表面有很多突起和微絨毛,可能是神經(jīng)球細(xì)胞維持球體、物質(zhì)和信息交換的重要結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)。
　　酒精造成神經(jīng)干細(xì)胞

5、線粒體損傷,損傷程度呈劑量效應(yīng)關(guān)系。25mM酒精引起線粒體輕度腫脹,50mM酒精引起細(xì)胞線粒體中度腫脹,嵴斷裂缺失。100mM劑量組可見(jiàn)細(xì)胞線粒體損傷程度進(jìn)一步加劇。掃描電鏡下酒精使神經(jīng)球結(jié)構(gòu)更為松散。酒精導(dǎo)致的線粒體損傷可能引起細(xì)胞凋亡。3酒精對(duì)胎鼠腦新皮質(zhì)神經(jīng)干細(xì)胞自我更新的影響及作用機(jī)制研究3.1酒精對(duì)胎鼠腦新皮質(zhì)神經(jīng)干細(xì)胞自我更新的影響
　　利用臺(tái)盼藍(lán)染色計(jì)數(shù)存活細(xì)胞、神經(jīng)干細(xì)胞成球率實(shí)驗(yàn)(成球個(gè)數(shù)和球徑)、BrdU摻入率

6、檢測(cè)神經(jīng)干細(xì)胞的自我更新能力。結(jié)果表明,隨酒精劑量增加活細(xì)胞數(shù)下降,100mM酒精組活細(xì)胞數(shù)是對(duì)照組的78％。神經(jīng)干細(xì)胞成球率隨酒精劑量增加而下降,神經(jīng)球直徑也隨酒精劑量增加而降低,呈劑量依賴關(guān)系。BrdU摻入率反映DNA合成狀況,隨酒精劑量增加而下降,呈劑量效應(yīng)關(guān)系。該結(jié)果表明酒精能夠抑制神經(jīng)干細(xì)胞的自我更新。3.2酒精對(duì)胎鼠腦新皮質(zhì)神經(jīng)干細(xì)胞細(xì)胞周期和相關(guān)調(diào)控基因的影響
　　采用流式細(xì)胞術(shù)分析了神經(jīng)干細(xì)胞的細(xì)胞周期。酒精使S期

7、和G2/M期細(xì)胞數(shù)下降,G0/G1期細(xì)胞數(shù)增加。未觀察到凋亡峰。上述結(jié)果表明酒精能夠引起神經(jīng)干細(xì)胞G0/G1期阻滯,延緩細(xì)胞周期進(jìn)程。
　　利用熒光定量PCR技術(shù)檢測(cè)細(xì)胞周期抑制基因p53、p16、p21和p27Mrna的表達(dá)。酒精能夠誘導(dǎo)神經(jīng)干細(xì)胞p16和p2lmRNA表達(dá)的增加,p53和p27mRNA表達(dá)未發(fā)生顯著性改變(P>0.05)。表明酒精可通過(guò)細(xì)胞周期抑制基因p16和p21抑制G1/S細(xì)胞周期檢驗(yàn)點(diǎn)的轉(zhuǎn)換。細(xì)胞周期阻滯

8、可能預(yù)示著神經(jīng)干細(xì)胞命運(yùn)的轉(zhuǎn)變,向更為成熟的前體細(xì)胞分化的啟動(dòng)。3.3酒精對(duì)胎鼠腦新皮質(zhì)神經(jīng)干細(xì)胞標(biāo)志物的影響
　　利用熒光定量PCR。技術(shù)檢測(cè)神經(jīng)干細(xì)胞標(biāo)志物Nestin、Sox2和CD133Mrna的表達(dá),利用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)SOX2蛋白的表達(dá)。神經(jīng)干細(xì)胞NestinMrna表達(dá)隨酒精劑量增加而下降,Sox2和CD133mRNA表達(dá)未受影響,SOX2陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)未受影響,但豐度增加。酒精抑制Nestin和促進(jìn)SOX2表達(dá)可能與分化

9、的啟動(dòng)有關(guān)。3.4酒精對(duì)胎鼠腦新皮質(zhì)神經(jīng)干細(xì)胞Egfr和FgfrlMrna表達(dá)的影響利用熒光定量PCR技術(shù)檢測(cè)神經(jīng)干細(xì)胞生長(zhǎng)因子受體Egfr和FgfrlMrna的表達(dá)。酒精能促進(jìn)兩者的表達(dá),可能與酒精誘導(dǎo)神經(jīng)干細(xì)胞向更為成熟的神經(jīng)前體細(xì)胞分化有關(guān)。3.5酒精對(duì)胎鼠腦新皮質(zhì)神經(jīng)干細(xì)胞Wnt通路相關(guān)基因表達(dá)的影響利用熒光定量PCR技術(shù)檢測(cè)神經(jīng)干細(xì)胞Wnt通路相關(guān)基因β-catenin、c-myc和CyclinDlmRNA的表達(dá)。酒精能誘導(dǎo)c

10、-mycMrna表達(dá)上調(diào),β-catenin和CyclinDlmRNA表達(dá)未發(fā)生改變。C-myc除了促細(xì)胞增殖作用外,還有誘導(dǎo)凋亡的作用。結(jié)果表明酒精可能通過(guò)上調(diào)c-myc引發(fā)凋亡。4酒精對(duì)胎鼠腦新皮質(zhì)神經(jīng)干細(xì)胞凋亡的影響及作用機(jī)制研究4.1酒精對(duì)胎鼠腦新皮質(zhì)神經(jīng)干細(xì)胞凋亡的影響
　　利用AnnexinV/PI法檢測(cè)酒精染毒3d和4d的細(xì)胞凋亡率。50mM和100mM酒精染毒3d和4d均能誘導(dǎo)神經(jīng)干細(xì)胞早期凋亡的增加。100mM酒

11、精染毒3d和4d均能導(dǎo)致神經(jīng)干細(xì)胞膜電位的顯著性下降。晚期凋亡率無(wú)顯著性變化。4.2酒精對(duì)神經(jīng)干細(xì)胞凋亡相關(guān)基因表達(dá)的影響
　　利用熒光定量PCR技術(shù)檢測(cè)神經(jīng)干細(xì)胞凋亡相關(guān)基因’Bcl-2、Survivin、Bax、Bad和Caspase3Mrna的表達(dá)。酒精染毒2d,50mM和100mM酒精抑制凋亡抑制基因Survivin的表達(dá),酒精染毒3d,25-100mM酒精使促凋亡基因Bax表達(dá)增加。酒精染毒4d,各基因表達(dá)沒(méi)有變化。利用

12、分光光度法試劑盒檢測(cè)Caspase3蛋白活性,酒精染毒2-4d均未引起Caspase3蛋白活性的顯著增加。
　　結(jié)合前文中發(fā)現(xiàn)酒精引起神經(jīng)干細(xì)胞c-myc表達(dá)增加,可認(rèn)為25-100mM酒精染毒2-4d,神經(jīng)干細(xì)胞出現(xiàn)早期凋亡事件,凋亡抑制基因survivin下調(diào),促凋亡基因c-myc上調(diào),bax隨之上調(diào),bcl-2/bax比值下降。線粒體途徑參與了酒精誘導(dǎo)的神經(jīng)干細(xì)胞早期凋亡。5酒精對(duì)胎鼠腦新皮質(zhì)神經(jīng)干細(xì)胞分化的影響