人胚胎干細胞分化為可自我更新的神經干細胞.pdf

1、人胚胎干細胞（Human Embryonic Stem Cells，hESCs）是一種可以在體外穩(wěn)定自我更新，并具有分化為成人機體任何一種細胞潛能的多能干細胞(Pluripotent StemCells，PSCs)。通過hESCs定向分化可以得到通常情況下難以獲得，但對疾病治療具有重要價值的細胞。因此，多能干細胞在再生醫(yī)學中具有重要的應用價值。對神經系統(tǒng)而言，許多神經退行性疾病通常涉及神經元的死亡和缺失，如中腦多巴胺神經元死亡與帕金森病

2、（Parkinson's Disease，PD）密切相關，而阿爾茨海默癥(Alzheimer's Disease，AD)患者存在前腦基底膽堿能神經元(Basal ForebrainCholinergic Neurons，BFCNs)的缺失。細胞移植有望改善神經退行性疾病的病理狀態(tài)，對其產生重要的治療作用，而通過人多能干細胞(Human Pluripotent Stem Cells，hPSCs)的定向分化獲得特定類型的神經元將為神經退行性

3、疾病的細胞治療提供重要支持。目前利用化學生物學手段，即用活性小分子化合物調控干細胞命運已經成為干細胞研究中的熱點領域。小分子化合物通過靶向特定分子在調控細胞信號轉導，細胞能量代謝和表觀遺傳學機制等方面具有顯著的優(yōu)勢:如其功能具有可逆性、其作用強度可以通過自身濃度進行調節(jié)等。課題組前期研究發(fā)現(xiàn)用小分子化合物同時抑制GSK3（Glycogen Synthase Kinase3）以及TGFβ(Transforming Growth Facto

4、rβ)和Notch信號通路，可高度特異的將人胚胎干細胞在一周時間內誘導分化為原始神經干細胞。但是，通過該方法獲得的神經上皮通常具有后端化的表型，這可能與抑制GSK3導致Wnt信號通路的激活有關。本課題擬在前期研究的基礎上，利用化學生物學手段誘導hESCs分化獲得具有前腦表型的神經干細胞。
　　本課題以人胚胎干細胞系H1和HUES9為研究對象，用無血清無飼養(yǎng)層的培養(yǎng)體系培養(yǎng)和傳代。在光鏡下hESCs邊緣清晰，排列緊密，細胞核大而細胞

5、質少;細胞免疫熒光染色OCT4（Octamer-binding Transcription Factor4）陽性，表明hESCs處于未分化狀態(tài)。通過聯(lián)合使用TGFβ抑制劑SB431542和Notch抑制劑RO4929097高效率的將人胚胎干細胞誘導分化為PAX6(Paired Box Protein6)和Nestin陽性的神經上皮。進一步，利用低濃度GSK3抑制劑CHIR99021和SB431542，可維持神經上皮的長期自我更新，該細胞

6、表達前腦標志FOXG1(Forkhead Box Protein G1)、OTX2(Orthodenticle Homeobox2)，神經干細胞標志PAX6、早期神經細胞標志Nestin，和細胞增殖標志分子Ki67，表明該細胞是具有前腦表型的前腦神經干細胞（Forebrain Neural Stem Cells，fNSCs）。該細胞可以響應SHH(Sonic Hedgehog)誘導的腹側化作用，得到MAP2(Microtubule-As

7、sociated Protein2)、NKX2.1(NK2Homeobox1)和GABA（Gamma-Aminobutyric Acid）陽性的腹側前腦中間神經元。然而，值得注意的是，上述神經干細胞PAX6陽性，提示其在背腹軸上可能偏向背側定位。隨后研究中，我們嘗試在神經誘導過程中加入腹側誘導因子SHH是否可以獲得具有腹側表型的神經干細胞。通過使用腹側誘導因子SHH及其激活劑SAG(Smoothened Agonist)、TGFβ抑制劑

8、SB431542等誘導hESCs神經分化，得到腹側標志NKX2.1和前腦標志FOXG1陽性的腹側前腦神經干細胞(Ventral ForebrainNeural Stem Cells，vfNSCs)。該細胞可在GSK3抑制劑CHIR99021，TGFβ受體抑制劑SB431542和SHH存在的條件下自我更新，并表達前腦神經細胞標志FOXG1、OTX2，早期神經細胞標志Nestin和細胞增殖標志分子Ki67;此外，該細胞還表達腹側標志NKX2

9、.1，表明其具有腹側前腦神經干細胞的表型。進一步通過聯(lián)合使用Wnt抑制劑XAV-939、Notch抑制劑RO4929097和SHH，可將上述腹側前腦神經干細胞快速誘導分化為神經元。分化后的神經元表達腹側標志NKX2.1、ISL1(InsulinGene Enhancer Protein1)，神經元特異骨架蛋白MAP2，大多數(shù)神經元為GABA能神經元，表達GAD65（Glutamic Acid Decarboxylase65），且GABA

10、呈陽性;只有少部分細胞表達膽堿能神經元標志ChAT（Choline Acetyltransferase）。
　　綜上所述，本課題通過化學生物學手段成功的將人胚胎干細胞定向分化為前腦神經干細胞，并可進一步高效的將神經干細胞分化為前腦抑制性中間神經元。本課題建立的定向分化體系不僅可以作為體外研究前腦發(fā)育的細胞平臺，同時有效的前腦抑制性中間神經元獲取手段也有望為阿爾茨海默癥、Huntington舞蹈癥等神經退行性疾病的干細胞治療提供穩(wěn)定