茶氨酸對神經(jīng)干細(xì)胞增殖和分化的影響.pdf

1、茶氨酸(Theanine)又名L-茶氨酸、N-乙基-L-谷氨酰胺，為一種非蛋白質(zhì)氨基酸，是綠茶中的一種天然氨基酸，天然存在的茶氨酸以L型為主，僅以游離形式存在。茶氨酸可以從茶葉中提取，又可以通過多種人工合成方法獲得。茶氨酸為水溶性氨基酸，極易溶于水而不溶于乙醇或乙醚，在腸道吸收后需要依賴鈉離子轉(zhuǎn)運體轉(zhuǎn)運入血，并可以通過亮氨酸轉(zhuǎn)運系統(tǒng)跨過血腦屏障轉(zhuǎn)運進(jìn)入腦部。有研究表明，茶氨酸毒性作用非常小。臨床研究發(fā)現(xiàn)，茶氨酸可參與調(diào)節(jié)人體內(nèi)多個系統(tǒng)的

2、調(diào)節(jié)，并對神經(jīng)系統(tǒng)具有保護(hù)作用。茶氨酸與谷氨酸結(jié)構(gòu)類似，它可能與谷氨酸競爭性結(jié)合谷氨酸受體，參與調(diào)節(jié)了神經(jīng)系統(tǒng)的發(fā)育。
　　神經(jīng)干細(xì)胞（neural stem cells，NSCs）是干細(xì)胞的一種，是存在于腦和脊髓中的未分化細(xì)胞。與其他干細(xì)胞一樣，神經(jīng)干細(xì)胞也具有分裂增殖和多樣分化的特點，具備自我更新能力。它能夠分化為神經(jīng)元、神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞等多種類型的神經(jīng)組織細(xì)胞。神經(jīng)干細(xì)胞的各種功能是通過神經(jīng)元和神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞共同完成的，當(dāng)中樞神經(jīng)

3、系統(tǒng)中的許多疾病，如:腦損傷、腦出血、帕金森病等都存在不同程度的神經(jīng)細(xì)胞缺失或變形死亡，并由此引起神經(jīng)功能的損害，神經(jīng)干細(xì)胞就可以分化出新的神經(jīng)元來代替受損的神經(jīng)元以修復(fù)大腦。但是，茶氨酸對損傷大腦中的神經(jīng)干細(xì)胞有沒有作用，或是有何種作用，至今尚未見到報道。因此我們在體外分離的NSCs中加入茶氨酸，采用MTS、免疫熒光、RT-PCR、Westen blot等技術(shù)方法，研究茶氨酸對體外分離NSCs可能發(fā)揮的作用。
　　1.NSCs的

4、分離、培養(yǎng)和鑒定
　　NSCs體外分離、培養(yǎng)取決于多反面因素，如:動物種屬、年齡、取材部位、接種密度、培養(yǎng)基營養(yǎng)條件等。研究發(fā)現(xiàn)，胚胎鼠相比于新生鼠和成年鼠，其腦皮質(zhì)中的NSCs含量最高，且具有更高的擴(kuò)增及分化能力。我們從12.5d的昆明胎鼠大腦中分離NSCs并培養(yǎng)，機(jī)械吹打結(jié)合200目鋼網(wǎng)過濾獲取細(xì)胞懸液，接種于無血清的神經(jīng)干細(xì)胞培養(yǎng)基。應(yīng)用Brdu標(biāo)記及Nestin免疫熒光染色技術(shù)檢測其增值能力。應(yīng)用微管相關(guān)蛋白2(micro

5、tubule associated protein2，MAP2)、膠質(zhì)纖維酸性蛋白(glial fibrillary acidic protein，GFAP)免疫熒光染色檢測其分化能力。結(jié)果顯示我們體外分離、培養(yǎng)的NSCs具備較好的自然增值和分化能力，可用于后續(xù)的實驗研究。
　　2.茶氨酸對NSCs增值和分化的影響
　　用MTS法檢測不同濃度茶氨酸對NSCs細(xì)胞活性的影響，從而選擇最佳給藥濃度，實驗設(shè)置0、1μmol/L、1

6、0μmol/L、100μmol/L、1mmol/L、10mmol/L六個濃度，結(jié)果顯示MTS法檢測不同濃度的茶氨酸對NSCs活性的影響不同，呈現(xiàn)一定的劑量依賴趨勢，100μmol/L濃度的茶氨酸作用最為明顯，所以我們選擇100μmol/L茶氨酸的濃度作為后續(xù)實驗的藥物濃度。然后將培養(yǎng)的NSCs分為兩部分，每部分分為2組:對照組和加藥組（茶氨酸最終加藥濃度為100μmol/L）用于檢測增殖能力的NSCs加入無血清培養(yǎng)基（茶氨酸濃度為100

7、μmol/L），培養(yǎng)48h培養(yǎng)后進(jìn)行BrdU染色，用于檢測分化能力的NSCs加入分化培養(yǎng)基（茶氨酸濃度為100μmol/L），培養(yǎng)5d后進(jìn)行MAP2和GFAP免疫熒光染色，染色后計數(shù)陽性細(xì)胞，并進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析，并利用RT-PCR以及Westen blot檢測MAP2和GFAP表達(dá)。
　　結(jié)論:100μmol/L茶氨酸處理組MTS檢測的吸光度值顯著增高(P＜0.05);加藥組BrdU陽性細(xì)胞比率、MAP2陽性細(xì)胞比率明顯高于對照組(