幾丁質(zhì)酶缺失型重組桿狀病毒載體的構(gòu)建及腸道病毒EV71類病毒顆粒的表達(dá)與純化.pdf

1、雖然昆蟲桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)已經(jīng)成功表達(dá)了數(shù)千種重組蛋白，但由于各種原因目的蛋白產(chǎn)量很難達(dá)到較高水平，并且在該系統(tǒng)中，分泌性蛋白和膜結(jié)合糖蛋白很難表達(dá)或表達(dá)水平很低，因而，利用基因工程方法對桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)進(jìn)行優(yōu)化具有重要的應(yīng)用價值。
　　 蛋白降解一直以來是影響外源蛋白表達(dá)水平的主要問題，這是BEVS自身固有的問題。BEVS是一個裂解性系統(tǒng)，在病毒感染和表達(dá)的過程中，病毒本身表達(dá)出的蛋白酶會降解目的蛋白，特別是幾丁質(zhì)酶和半胱氨酸蛋

2、白酶，嚴(yán)重影響目的蛋白的得率。與此同時，幾丁質(zhì)酶是分泌性蛋白，會對外源分泌性蛋白進(jìn)入分泌途徑造成強(qiáng)大的競爭力。
　　 本研究基于λ噬菌體Red重組系統(tǒng)、建立了一種適用于對桿狀病毒Bacmid進(jìn)行基因改造的重組方法。并進(jìn)一步以AcMNPV Bacmid上的ChiA基因基因敲除為例闡述該重組系統(tǒng)的可行性。PCR及WB結(jié)果證實(shí)ChiA基因己被成功敲除，改造后的DH10Bac可應(yīng)用于任意外源蛋白的表達(dá)。該重組方法簡單高效易操作，將為Ba

3、c-to-Bac系統(tǒng)中桿狀病毒任意基因的改造提供極大的方便。
　　 2008年以來我國多次暴發(fā)了以EV71為主要病原體的手足口病疫情，EV71引起的手足口病常并發(fā)嚴(yán)重的中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷，造成較高的病死率和致殘率，嚴(yán)重危害兒童身體健康和生命安全。該病傳播途徑復(fù)雜，目前尚無疫苗與抗病毒治療藥物。類病毒顆粒（virus-like particle，VLP）是由病毒衣殼蛋白組成的空殼粒子，一方面由于不具有病毒的遺傳物質(zhì)而消除了滅活疫苗潛

4、在的危險(xiǎn)性，另一方面它能高密度地展示病毒抗原表位，引發(fā)強(qiáng)有力的特異性體液免疫和細(xì)胞免疫，因此是一種可開發(fā)的理想疫苗形式。
　　 本研究以大陸流行株（GenBank:FJ600325.1）為研究對象，首先借助Bac-to-Bac系統(tǒng)構(gòu)建能同時表達(dá)EV71 P1（多角體啟動子下）和3CD(p10啟動子下)蛋白的幾丁質(zhì)酶缺失型重組桿狀病毒，并于Sf21細(xì)胞中成功進(jìn)行EV71VLP的表達(dá)。
　　 其次，通過對宿主細(xì)胞、感染劑量、

5、收獲時間、FBS培養(yǎng)濃度等表達(dá)條件進(jìn)行優(yōu)化，確定以2％FBS濃度培養(yǎng)sf21條件下，100ul/板病毒劑量攻毒3天后收獲細(xì)胞沉淀可獲得較高的目的蛋白產(chǎn)量。
　　 最后，利用36株EV71特異性單抗對重組蛋白活性進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)重組抗原與單抗的反應(yīng)性很好。變性處理可能會破壞重組抗原的構(gòu)象表位，導(dǎo)致重組抗原與構(gòu)象型單抗的反應(yīng)性消失。提示本研究表達(dá)的EV71重組抗原存在與天然病毒類似的構(gòu)象表位，有可能能引起有效的免疫反應(yīng)。進(jìn)一步超速離心