腸道病毒71型(EV71)小鼠模型的建立及在疫苗評(píng)價(jià)中的應(yīng)用.pdf

1、腸道病毒71型（Enterovirus71，EV71）引起的腸道病毒EV71感染疾病多發(fā)生于嬰幼兒，通常引起患者手足口病和皰疹性咽峽炎，嚴(yán)重時(shí)引起無菌性腦膜炎、腦干腦炎和脊髓灰質(zhì)炎樣的麻痹等疾病，致殘及病死率較高。
　　 自1969年發(fā)現(xiàn)以來，EV71病毒已在世界范圍內(nèi)引起十多次爆發(fā)與流行，EV71病毒在中國大陸的流行自80年代首次報(bào)道以來，已經(jīng)存在了20多年。2009年春季我國報(bào)告40，000例EV71引發(fā)的手足口病例，其中重

2、癥病例80例。今年同期，手足口病疫情在我國又有卷土重來的趨勢(shì)，截止5月4日，全國報(bào)告手足口病例427，278例，死亡260例，其中，重癥及死亡患者以感染EV71者居多，且多為5歲以下學(xué)齡前兒童。
　　 很多研究報(bào)道已經(jīng)證實(shí)了研制一種腸道病毒疫苗的可行性，但由于缺乏適合有效的動(dòng)物模型用于評(píng)價(jià)疫苗，目前，我們?nèi)詻]有特效的藥物或是疫苗來防治EV71的感染，所以及時(shí)了解動(dòng)物感染情況和建立模型，顯得非常迫切和重要。近年來，科學(xué)家通過在乳鼠

3、和短尾猴等動(dòng)物體內(nèi)進(jìn)行的EV71感染實(shí)驗(yàn)對(duì)病毒的致病機(jī)制、感染途徑、體內(nèi)散布等方面進(jìn)行了研究，發(fā)現(xiàn)不是所有的EV71臨床分離株都能感染動(dòng)物，也不是同一個(gè)EV71毒株感染不同動(dòng)物出現(xiàn)的癥狀都相同，這可能是由于EV71病毒基因型和亞型的不同。所以，在本實(shí)驗(yàn)中我們針對(duì)目前我國EV71方面研究的匱乏與防治藥物和疫苗研制的需要，運(yùn)用阜陽地區(qū)手足口病患者臨床分離EV71株進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，以期建立一個(gè)適用的EV71動(dòng)物感染模型，用于EV71疫苗的研制和評(píng)價(jià)

4、工作。
　　 EV71病毒對(duì)動(dòng)物的感染不但有物種依賴性，還有年齡依賴性。在預(yù)實(shí)驗(yàn)中，我們通過對(duì)不同年齡段的ICR小鼠、SCID小鼠、豚鼠、中國恒河猴等用不同的途徑大劑量感染病毒后發(fā)現(xiàn)，1日齡ICR小鼠是對(duì)本實(shí)驗(yàn)室毒株最敏感的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，腹腔注射途徑是最佳的感染途徑。挑選到合適的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物后，為了得到感染力更強(qiáng)的毒株，我們借鑒臺(tái)灣科學(xué)家復(fù)強(qiáng)毒株的方法，在小鼠肌肉組織連續(xù)傳代制備了EV71小鼠適應(yīng)株，通過對(duì)兩毒株的比較研究發(fā)現(xiàn)：傳代株較

5、原代株有較強(qiáng)的肌肉組織嗜性和RD細(xì)胞毒性；感染1日齡小鼠后在各組織中的分布更廣；在肌肉組織中的病毒量有所提高；兩毒株VP1區(qū)氨基酸系列有一定差異，可能與病毒毒力存在一定關(guān)系。利用所建立病毒檢測(cè)和模型評(píng)價(jià)體系我們對(duì)感染小鼠進(jìn)行了臨床表現(xiàn)、病原學(xué)、病毒分子生物學(xué)和病理學(xué)等方面的研究，繪制出傳代株感染小鼠后7天內(nèi)病毒的復(fù)制曲線；發(fā)現(xiàn)感染后小鼠小腸、骨骼肌、心肌各組織出現(xiàn)特定病理變化；免疫組化在骨骼肌中發(fā)現(xiàn)病毒定位，從而建立起EV71小鼠感染模

6、型，并成功運(yùn)用于本研究所EV71亞單位疫苗的研制工作中。
　　 本實(shí)驗(yàn)中針對(duì)EV71病毒建立的半定量RT-PCR，Real time RT-PCR，IEA，IFA，病毒分離，免疫組織化學(xué)等方法為EV71病毒的感染特點(diǎn)和致病機(jī)制等方面的研究提供了良好的技術(shù)基礎(chǔ)，所建立的EV71感染ICR小鼠動(dòng)物模型，為病毒疫苗和抗病毒藥物的研究提供了確實(shí)可用的動(dòng)物評(píng)價(jià)工具。同時(shí)通過對(duì)EV71毒株的體內(nèi)、體外特性，包括細(xì)胞學(xué)和免疫學(xué)等方面特性的研究