腸道病毒71型毒株的的全基因序列分析及重組疫苗載體的構建.pdf

1、近二十年，手足口病在我國兒童中的發(fā)病率呈上升趨勢。而腸道病毒71型（Enterovirus71，EV71）作為手足口病的主要病原，其致病機制和免疫應答機制尚未闡明。本實驗對2011年分離自廣州并保存于本室的 EV71毒株進行全基因組序列測定，并對其進化特點進行分析。
　　疫苗是控制傳染病流行最為有效而經濟的手段。目前，雖然已經開展多種 EV71疫苗的研究，并取得了一定進展，但是至今仍未開發(fā)出有醫(yī)藥應用價值的疫苗。因此，本研究進一步

2、克隆了該 EV71毒株的 VP1基因片段，并在我室已成功構建的柯薩奇病毒（Coxsackievirus B3，CVB3）感染性載體基礎上，利用克隆到的 EV71 VP1片段來代替CVB3感染載體的 VP1基因片段，以期獲得表達 EV71 VP1的重組病毒，為 EV71疫苗研究提供新的思路。
　　主要研究方法：
　　1.將標本處理后，取上清接種到人橫紋肌肉瘤 RD細胞進行擴增，擴增之后的病毒通過細胞培養(yǎng)蝕斑法純化；
　　

3、2.提取病毒 RNA，采用反轉錄合成病毒cDNA，設計的9對引物對 EV71毒株全基因組進行克隆，并在此基礎上對該毒株全基因組（未包括多聚腺苷酸尾）進行核苷酸序列的測定；
　　3.參考 EV71各型別的代表株以及中國大陸其它地區(qū)測定的 EV71病毒序列，應用Bioedit、 Mega、 SimpLot等生物學軟件對該毒株的全基因組及各區(qū)段的核苷酸及氨基酸序列進行系統的分析；
　　4.對保存在本實驗室的 EV71毒株進行測序、

4、分析的基礎上通過PCR的方法克隆出VP1蛋白的編碼序列；
　　5.本實驗室前期已構建CVB3感染性載體，并成功包裝出病毒，經過驗證為減毒株。本研究通過酶切連接的方法，利用EV71的 VP1編碼序列置換出 CVB3感染載體中原有的 VP1編碼序列；
　　6.對重組質粒進行真核細胞轉染，用蛋白質印記法檢測轉染細胞中EV71 VP1蛋白表達。
　　研究結果：
　　1.根據測序結果，成功拼接出該 EV71毒株的基因組全序

5、列，命名為 EV71 IM11株，并已被 GenBank收錄，登錄號為 KM673244；
　　2. IM11毒株的基因組具有腸道病毒基因組的基本特征，全長7408個核苷酸（nucleotide，nt），其中5'端非編碼區(qū)743nt，3'端非編碼區(qū)89nt，兩個非編碼區(qū)之間為6579nt長的單個開放閱讀框，編碼含2193氨基酸的多聚蛋白，編碼區(qū)內未見有核苷酸的插入或缺失；
　　3.通過進化分析得知 IM11株為 EV71 C

6、4a基因亞型，并和分離于佛山的一株病毒有較高的同源性；
　　4.通過進化分析，推測在我國 C4a基因亞型有兩種進化趨勢；
　　5.克隆出 EV71 VP1基因，并利用酶切連接的方法，成功地用EV71 VP1代替 CVB3 VP1，構建出重組質粒；
　　6.利用蛋白標記方法檢測出重組質粒在真核細胞中有 EV71 VP1蛋白的表達。
　　結論：
　　本研究獲得2011年分離自廣州保存于本室的 EV71毒株全基因