生長(zhǎng)因子基因在損傷兔關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞中的表達(dá).pdf

1、目的:分離、培養(yǎng)及鑒定體外兔膝關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞；建立軟骨細(xì)胞培養(yǎng)方法并獲得足量穩(wěn)定的軟骨細(xì)胞；建立體外兔關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞損傷模型；通過(guò)實(shí)時(shí)熒光PCR技術(shù)，分析損傷后不同時(shí)間點(diǎn)的生長(zhǎng)因子表達(dá)。
　　方法:1.取4周齡健康新西蘭兔膝關(guān)節(jié)軟骨，以機(jī)械分離和酶階段消化分離相結(jié)合的方法獲取膝關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞；體外培養(yǎng)、傳代，觀察不同培養(yǎng)階段細(xì)胞形態(tài)、生長(zhǎng)；CCK-8法測(cè)定增殖，繪制生長(zhǎng)曲線；行甲苯胺藍(lán)及Ⅱ型膠原免疫熒光染色鑒定軟骨細(xì)胞。2.軟骨細(xì)胞體外

2、培養(yǎng)傳代，將生長(zhǎng)狀態(tài)良好的第三代關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞接種于六孔板內(nèi)并劃傷，建立體外培養(yǎng)關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞劃傷模型。3.顯微鏡下觀察軟骨細(xì)胞在劃傷前后的形態(tài)變化；通過(guò)實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)檢測(cè)劃傷前和劃傷后1，3，7天四個(gè)時(shí)間點(diǎn)的血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）、堿性成纖維生長(zhǎng)因子（basic fibroblast growth factor，bFGF）、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β1（transf

3、orming growth factor-β1，TGF-β1）、胰島素樣生長(zhǎng)因子-Ⅰ（insulin-like growth factor，IGF-1）和Ⅱ型膠原（collagenⅡ）基因mRNA表達(dá)。
　　結(jié)果:1.兔軟骨軟骨經(jīng)兩步消化，可獲取高純度的軟骨細(xì)胞，細(xì)胞活性率可達(dá)95％以上，甲苯胺藍(lán)染色及免疫熒光呈陽(yáng)性結(jié)果。原代細(xì)胞和第一代細(xì)胞呈多角形，傳代4~5代后，細(xì)胞形態(tài)逐漸由多角形變?yōu)樗笮?，基質(zhì)分泌氨基多糖(GAGs)和膠原

4、染色變淺。2.成功建立軟骨細(xì)胞體外培養(yǎng)劃傷模型，細(xì)胞劃傷后劃痕兩側(cè)邊緣整齊，隨著培養(yǎng)時(shí)間推移，細(xì)胞伸出突起并向劃痕區(qū)延伸，劃痕區(qū)開(kāi)始出現(xiàn)軟骨細(xì)胞，并相互間發(fā)生融合。3.在細(xì)胞劃傷模型中，細(xì)胞劃傷后VEGF和bFGF基因都呈明顯低水平表達(dá)。而TGF-β1、IGF-Ⅰ和Ⅱ型膠原基因卻呈現(xiàn)較高表達(dá)水平。VEGF基因在細(xì)胞損傷第3天的表達(dá)高峰后開(kāi)始回落，而bFGF、TGF-β1及Ⅱ型膠原基因在損傷的第1天表達(dá)明顯降低（P<0.05），隨后呈現(xiàn)升