凋亡與增殖相關(guān)基因在損傷兔關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞中的表達(dá)變化.pdf

1、目的：建立兔關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞損傷模型并分析細(xì)胞損傷后不同時(shí)間點(diǎn)的半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶3（Caspase-3）與細(xì)胞增殖核抗原（PCNA）基因表達(dá)變化。
　　方法：⑴取4周齡健康新西蘭兔膝關(guān)節(jié)軟骨，以機(jī)械分離和酶消化分離相結(jié)合的方法獲取膝關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞，利用Ⅱ型膠原免疫熒光染色鑒定軟骨細(xì)胞。⑵建立細(xì)胞劃傷模型。⑶實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)檢測正常組和劃傷組caspase-3，PCNA和二型膠原蛋白（collagenⅡ）基因mRNA表達(dá)

2、變化。⑷蛋白免疫印跡法（Western blot）檢測正常組和劃傷組caspase-3，PCNA蛋白表達(dá)變化。
　　結(jié)果：①通過免疫熒光技術(shù)證實(shí)：分離培養(yǎng)兔關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞成功。②參照近幾年細(xì)胞損傷文獻(xiàn)，建立軟骨細(xì)胞體外劃傷模型，關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞劃傷后，外力直接作用區(qū)域軟骨細(xì)胞胞體完全消失，呈空白區(qū)域，鄰近部位軟骨細(xì)胞未見改變。損傷1 d時(shí)，劃痕周邊細(xì)胞皺縮，胞質(zhì)折光性增強(qiáng)，顆粒物質(zhì)聚集。損傷3d時(shí)，劃痕周邊細(xì)胞核大，胞質(zhì)清晰，自胞體向空

3、白區(qū)域伸出較多突起，漸有劃痕兩側(cè)細(xì)胞相互聯(lián)系。損傷后7 d，空白區(qū)域已被大部分增殖細(xì)胞覆蓋。③實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)檢測顯示：在損傷后1 d組的軟骨細(xì)胞的caspase-3 mRNA表達(dá)比正常組升高，損傷后3 d組與7 d組caspase-3 mRNA表達(dá)均較正常組及損傷后1 d組相比明顯下降，且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），其中損傷后7 d組caspase-3 mRNA表達(dá)最低；與正常組相比，損傷后1 d組PCNA mRNA表達(dá)下

4、降，損傷后3 d組與1 d組相比未見變化，7 d組與1d組相比表達(dá)上升；與正常組相比，損傷后1天組collagenⅡmRNA表達(dá)明顯低于正常細(xì)胞水平（P<0.05），損傷后3d組與7 d組較1 d組上升，其中第7天時(shí)，幾乎達(dá)到正常水平。④蛋白免疫印跡法（Western blot）檢測顯示：蛋白表達(dá)水平與基因表達(dá)水平相似。在損傷后1 d組的軟骨細(xì)胞的caspase-3蛋白表達(dá)比正常組升高，在3d組達(dá)到最高峰，5d組出現(xiàn)降低，7d組恢復(fù)至正

5、常組水平，正常組與7d組均較3 d組有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P<0.05）；PCNA蛋白表達(dá)在損傷后1d組與3d組出現(xiàn)降低，5d組與7d組出現(xiàn)上升且3d組與5d組相比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P<0.05）。
　　結(jié)論：在體外關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞損傷模型中發(fā)現(xiàn)：在關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞受到機(jī)械性損傷刺激下，軟骨細(xì)胞在損傷早期出現(xiàn)細(xì)胞凋亡增強(qiáng)，隨后細(xì)胞自身調(diào)節(jié)，增殖能力增強(qiáng)，凋亡現(xiàn)象減弱。說明關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞在體外培養(yǎng)存在自身抗凋亡能力。這為我們進(jìn)一步了解軟骨細(xì)胞損傷后生物