體外沖擊波對體外培養(yǎng)兔關(guān)節(jié)軟骨細胞增殖及相關(guān)生長因子活性的影響.pdf

1、目的：
　　 關(guān)節(jié)軟骨缺損和損傷是骨關(guān)節(jié)外科常遇到的問題，常由創(chuàng)傷和各種疾?。ㄈ绻切躁P(guān)節(jié)炎、骨軟骨炎、骨壞死等）引起。關(guān)節(jié)軟骨損傷后自身修復(fù)能力有限，大的關(guān)節(jié)軟骨缺損常由纖維軟骨而不是正常的透明軟骨修復(fù)。纖維軟骨在生物化學(xué)和組織結(jié)構(gòu)上與透明軟骨不同，常因無力承擔長時間的關(guān)節(jié)內(nèi)各種機械應(yīng)力而退變。目前，關(guān)于促進關(guān)節(jié)軟骨缺損的修復(fù)、提高修復(fù)質(zhì)量方面的研究頗多。但臨床上尚無一種方法能高質(zhì)量的修復(fù)關(guān)節(jié)軟骨損傷并達到很好的遠期療效。

2、>　　 體外沖擊波療法（Extracorporeal Shock Wave Therapy，ESWT）作為骨科領(lǐng)域興起的新的非侵入性治療方法，在治療某些矯形外科和軟組織疾病方面較傳統(tǒng)外科方法存在許多優(yōu)勢。近年來，發(fā)現(xiàn)ESW在治療骨性關(guān)節(jié)炎（Osteoarthritis，OA）中有顯著療效，其作用機制未見相關(guān)分子生物學(xué)研究報道。
　　 本課題利用體外培養(yǎng)的正常原代軟骨細胞，施加不同能量強度的ESW刺激，探討ESW是否對關(guān)節(jié)軟骨細

3、胞的增殖有影響，檢測ESW對軟骨細胞增殖情況的影響， ESW促進軟骨修復(fù)作用的分子生物學(xué)機理、適合軟骨細胞增殖的能量范圍及ESW作為延緩OA發(fā)生發(fā)展的非侵入治療方法的可行性，為下步臨床應(yīng)用提供理論依據(jù)。
　　 方法：
　　 選用健康的3月齡新西蘭兔20只，酶法消化正常兔膝關(guān)節(jié)軟骨獲得軟骨細胞。培養(yǎng)并傳3代，用臺盼藍染色法測細胞存活率。將傳3代的軟骨細胞隨機分為四組，A組：ESW能量0.5×105Pa，200次；B組：ES

4、W能量1.5×105Pa，200次；C組：ESW能量2.5×1 05Pa，200次；D組：空白對照組。干預(yù)后培養(yǎng)48小時，通過臺盼藍染色計算細胞成活率，細胞爬片HE染色后倒置相差顯微鏡觀察形態(tài)，干預(yù)后各組軟骨細胞用臺盼藍染色檢測細胞存活率，CCK-8法生長曲線觀察增殖趨勢，ELISA檢測兔膝關(guān)節(jié)軟骨細胞bFGF、PCNA、CTGF、Collagen Ⅱ變化情況分析干預(yù)效果，了解ESW對兔膝軟骨細胞增殖活性的影響；用逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)法檢

5、測bFGF、CTGF、Collagerl Ⅱ mRNA的表達。記錄原始數(shù)據(jù)，各組數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差表示，兩組間均數(shù)比較采用兩樣本t檢驗，運用SPSS13.0統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)分析以相應(yīng)的統(tǒng)計方法進行統(tǒng)計，以p<0.05表示有統(tǒng)計學(xué)意義。
　　 結(jié)果：
　　 1、臺盼藍染色檢測細胞增殖：臺盼藍染色后，死細胞染成淡藍色，而活細胞拒染，鏡下觀察發(fā)現(xiàn)，經(jīng)ESW干預(yù)后，B組細胞活性為（95±3）％，與A組、C組、空白對照相比差異有統(tǒng)

6、計學(xué)意義（P<0.05）。
　　 2、生長曲線：ESW對正常兔膝軟骨細胞的影響顯著，最佳能量頻次200次和強度1.5×105Pa。ESW能量實驗組A和實驗組B在緩慢增長期和指數(shù)增長期均較實驗組C和空白對照組有所增加（P<0.05）。但實驗組B在第3日時間點與其他三組比較有統(tǒng)計學(xué)差異（P<0.05）。而且細胞增殖高峰提前，表明適當能量的ESW可以明顯在時間和數(shù)量上促進軟骨細胞的增殖。
　　 3、細胞爬片HE染色，倒置相差顯

7、微鏡觀察：酶法消化獲得正常兔膝原代軟骨細胞。倒置相差顯微鏡觀察，剛分離的軟骨細胞形態(tài)呈輪廓清晰的圓形，核明亮而清楚，具折光性、旋光性。懸浮在培養(yǎng)液中，細胞大小略有差異。4h后大部分細胞開始貼壁，細胞也逐漸變得扁平透亮。24小時后軟骨細胞開始出現(xiàn)突起，細胞逐漸變成多邊形。3天后，軟骨細胞進入對數(shù)生長期，細胞連片生長，邊緣細胞突起較長，細胞偏梭形，中央的細胞突起較短，呈多角形。7天軟骨細胞呈“鋪路石”樣改變。8天后細胞數(shù)量增多，胞漿內(nèi)容物增

8、加，部分細胞形成細胞團塊或軟骨結(jié)節(jié)。
　　 4、ELISA檢測 bFGF、PCNA、CTGF、Collagen Ⅱ顯示：各實驗組bFGF、PCNA、CTGF、Collagetl Ⅱ表達均有增加，有統(tǒng)計學(xué)差異（P<0.05）。尤其是對bFGF作用更加明顯，實驗組B（12.920±0.103）與空白對照組、實驗組A能量組和實驗組C相比有顯著性差異（P<0.01）。說明ESW通過促進對軟骨細胞有促增殖作用的生長因子的表達，來起到促進軟

9、骨細胞增殖的作用。
　　 5、RT-PCR法檢測bFGF、CTGF、Collagetl Ⅱ的表達：實驗組B中，各種生長因子的mRNA表達均較空白對照組增加，有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05），其中CTGF和Collagerl Ⅱ mRNA的表達實驗組A和實驗組B之間沒有統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）。此結(jié)果反應(yīng)出來的情況和ELISA法檢測結(jié)果一致。
　　 結(jié)論：
　　 1、ESW作為機械應(yīng)力在一定能量強度和頻次的情況下可顯

10、著促進軟骨細胞增殖。從細胞水平證實軟骨細胞是對ESW應(yīng)力敏感細胞，具有能量依賴性，為下步實驗應(yīng)用提供理論支持，為目前應(yīng)用ESW治療OA選用能量和次數(shù)參數(shù)提供參考范圍。
　　 2、本實驗通過ESW適當能量的干預(yù)，可以在較短時間內(nèi)培養(yǎng)出數(shù)量較大的軟骨細胞，為臨床實驗及組織工程中種子細胞提供充足的、表型穩(wěn)定的細胞。
　　 3、ESW促進軟骨細胞促增殖因子bFGF、CTGF表達，而這些生長因子反過來發(fā)揮軟骨保護功能。進而說明ES