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文檔簡介
1、單核細胞增生李斯特菌(Listeria monocytogenes,LM)是一種兼性胞內(nèi)寄生的革蘭氏陽性菌。LM主要通過消化道引起動物和人的感染,是一種重要的人畜共患病原菌,在臨床主要引起人和動物的腦膜炎、敗血癥及流產(chǎn)等,對畜牧業(yè)和人類生命健康造成巨大的威脅,被 WHO列為四大食源性致病菌之一。
在 LM感染宿主的過程中需要眾多的毒力因子參與,這些毒力因子的編碼基因主要集中在 LM致病島1(LIPI-1)和致病島2(LIPI-
2、2)2個區(qū)域中,其中LIPI-1含有6個基因,依次為 prfA、plcA、hly、mpl、actA、plcB;LIP-2又稱為內(nèi)化素小島,主要編碼一些小分子的內(nèi)化素。近年來的研究發(fā)現(xiàn),LM非編碼ncRNA在調(diào)控其生長、基因表達、糖代謝、金屬離子轉(zhuǎn)運、生物膜形成、胞內(nèi)寄生及環(huán)境應激過程中也扮演了重要的角色,其調(diào)控模式已經(jīng)成為 LM調(diào)控網(wǎng)絡中的最重要作用方式之一。根據(jù) ncRNAs的調(diào)控機制,LM ncRNAs可以分為3種:順式作用 RNA
3、(Cis-acting RNAs,如核糖開關(guān))、反義 RNA(Anti-Sense RNAs,asRNAs)和反式編碼的小 RNA(Trans-encoded small RNAs,sRNAs)。rli87基因?qū)儆?sRNA,然而目前有關(guān) rli87基因的生物學功能尚不清楚。本研究應用同源重組技術(shù)構(gòu)建 rli87基因缺失株 LM-?rli87,研究了 ncRNA rli87缺失對 LM生長特性的影響,探討了 rli87在 LM環(huán)境應激能
4、力和致病性的調(diào)控作用。主要研究內(nèi)容及結(jié)果如下:
1、單核細胞增生李斯特菌 Rli87基因缺失株的構(gòu)建、鑒定及其生長特性研究
根據(jù) GenBank登錄的 LMEGD-e基因組序列(登錄號:AL591824),用DNAMAN軟件進行同源性分析,選擇保守區(qū)域,用 Primer5.0軟件設計擴增上、下游同源臂引物。利用 PCR技分別擴增 rli87基因上、下游同源臂,然后運用SOE-PCR技術(shù)融合上、下游同源臂,獲得 rli
5、87基因缺失片段。將 pMD19-T-△rli87和 pKSV7質(zhì)粒進行雙酶切,將 rli87基因缺失片段插入到穿梭載體 PKSV7上,構(gòu)建重組穿梭質(zhì)粒 pKSV7-△rli87。用電轉(zhuǎn)化的方法將 pKSV7-△rli87電轉(zhuǎn)化到LM EGD-e中,對陽性轉(zhuǎn)化子在氯霉素與42℃條件下傳代培養(yǎng)10代,獲得具有氯霉素抗性的單交換株;然后在無氯霉素42℃條件下傳代培養(yǎng)15代,得到只能擴增出一條584bp的目的片段無氯霉素抗性的雙交換基因重組缺
6、失株LM-△rli87。在無氯霉素壓力37℃條件下傳達培養(yǎng)20代,經(jīng) PCR檢測,結(jié)果證實 LM-△rli87缺失株具有良好的遺傳穩(wěn)定性。在37℃條件下培養(yǎng) LM EGD-e和 LM-△ rli87菌株,兩者生長差異不顯著(p>0.05),該結(jié)果證實 rli87基因缺失對37℃生長特性沒有影響。
2、Rli87基因缺失對單核細胞增生李斯特菌環(huán)境應激的影響
將 LM EGD-e強毒株和構(gòu)建的 LM-△rli87缺失株于
7、相同條件下培養(yǎng)后,分別測試在不同溫度、pH值、高滲透壓及氧化環(huán)境壓力條件下應急反應,并對應激相關(guān)基因的表達量進行檢測。選取低溫30℃和高溫42℃,測定相同培養(yǎng)條件下不同時間點的 OD600nm值,并繪制不同溫度條件下的生長曲線。結(jié)果在不用溫度條件下,LM-△rli87生長速度明顯高于 LMEGD-e(p<0.05)。在不同 pH值生長條件下,當 pH=9時兩株菌生長差異顯著(P<0.05);在2% H2O2氧化環(huán)境中出現(xiàn)生長停滯,活菌量
8、隨著時間的變化呈下降趨勢,但 LM-△rli87活菌量始終低于 LM EGD-e(P<0.05);在 pH=9時,與 LM EGD-e菌株相比,LM-△rli87缺失株 rsbV、rsbW、hpt、clpP、ctsR5個應激相關(guān)基因的表達量均上升,表明在堿性環(huán)境中 rli87對這5個應激相關(guān)基因具有調(diào)節(jié)作用。
3、Rli87基因缺失對單核細胞增生李斯特菌致病力的影響
將 LM EGD-e與構(gòu)建的 rli87基因缺失株
9、分別感染巨噬細胞 RAW264.7和BALB/C小鼠,測其胞內(nèi)細菌計數(shù)、細胞粘附率的計算以及存活小鼠的統(tǒng)計,通過 Real-time RT-PCR毒力基因表達量檢測的方法檢測五個毒力相關(guān)因子的表達量,并通過溶血試驗分析缺失株與野毒株的致病性差異。結(jié)果顯示,與 LM EGD-e相比,LM-△rli87缺失株的粘附率和侵襲力均下降;肝、脾載菌量減少;缺失株的半數(shù)致死量較野毒株升高了103個數(shù)量級;毒力基因 hly和 PrfA的轉(zhuǎn)錄水平顯著下
10、降。溶血試驗測定結(jié)果發(fā)現(xiàn),與強毒株 LM EGD-e相比,LM-△ rli87的溶血能力明顯降低。由于 LM的溶血能力由 LIPI-I上的 hly基因編碼,結(jié)果提示 rli87基因?qū)?hly基因的表達具有調(diào)控作用。
本研究通過 SOE-PCR技術(shù)與同源重組的方法成功構(gòu)建了 rli87基因缺失株,并研究了 Rli87基因缺失對 LM環(huán)境應激及致病力的影響。與 LM EGD-e相比,Rli87基因缺失株的環(huán)境應激能力下降,致病性減
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