2023年全國碩士研究生考試考研英語一試題真題(含答案詳解+作文范文)_第1頁
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文檔簡介

1、研究背景與目的:
  O-GlcNAc糖基化是一種動態(tài)的蛋白質(zhì)修飾過程,其廣泛參與細胞周期、基因轉(zhuǎn)錄、蛋白質(zhì)翻譯及信號轉(zhuǎn)導(dǎo)等生命活動,越來越多的證據(jù)表明O-GlcNAc糖基化的異常修飾與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān),而O-GlcNAc糖基化在膀胱癌中的作用與機制,尚未見報道。自噬是將細胞內(nèi)受損、變性或衰老的蛋白質(zhì)以及細胞器運輸?shù)饺苊阁w進行消化降解的過程,其在腫瘤發(fā)生、發(fā)展的過程中也發(fā)揮著重要作用。自噬作為細胞的一種重要的生理活動,受營

2、養(yǎng)狀態(tài)(包括O-GlcNAc糖基化)等多個應(yīng)激因素調(diào)節(jié),因此我們推測O-GlcNAc糖基化通過調(diào)節(jié)自噬而在膀胱癌中發(fā)揮作用。本實驗旨在研究膀胱癌中O-GlcNAc糖基化對細胞自噬的調(diào)節(jié)作用,以及O-GlcNAc糖基化調(diào)節(jié)自噬的具體分子機制,并闡明O-GlcNAc糖基化修飾對膀胱癌細胞生物學(xué)行為的影響,從而為膀胱癌的基礎(chǔ)研究提供新的視點,也為臨床治療膀胱癌提供新的思路。
  研究方法:
  1、選取人膀胱癌細胞株5637、RT

3、4,分別使用O-GlcNAc糖基化抑制劑、O-GlcNAc糖基化增強劑及PBS處理細胞,檢測細胞自噬的變化。檢測指標包括熒光顯微鏡下觀察自噬小體的數(shù)量,Western blot檢測細胞自噬相關(guān)蛋白的表達。
  2、構(gòu)建并篩選出5637-GFP-LC3/sh-CTRL、5637-GFP-LC3/sh-OGT和5637-GFP-LC3/sh-OGA細胞株,RT4-GFP-LC3/sh-CTRL、RT4-GFP-LC3/sh-OGT和R

4、T4-GFP-LC3/sh-OGA細胞株,5637-GFP-LC3/CTRL、5637-GFP-LC3/OGA-OE和5637-GFP-LC3/OGT-OE細胞株,熒光顯微鏡下觀察自噬小體的數(shù)量,Western blot檢測細胞自噬相關(guān)蛋白的表達。
  3、利用上述細胞株,使用不同方法調(diào)節(jié)細胞O-GlcNAc糖基化,Western blot檢測自噬相關(guān)蛋白的表達,初步選出O-GlcNAc糖基化的靶蛋白。構(gòu)建目的基因質(zhì)粒并轉(zhuǎn)染細胞,

5、Western blot檢測自噬相關(guān)蛋白的表達變化。
  4、利用上述細胞株,通過免疫共沉淀(Co-Immunoprecipitation,Co-IP)和Westernblot實驗,檢測O-GlcNAc糖基化直接作用的靶蛋白。
  5、使用基因敲除和基因過表達的方法調(diào)節(jié)目的基因,Western blot檢測O-GlcNAc糖基化及相關(guān)蛋白的表達。
  6、體外實驗:調(diào)節(jié)5637、RT4細胞O-GlcNAc糖基化,檢測細

6、胞生物學(xué)活性的變化,包括:MTT和平板克隆形成能力檢測細胞增殖能力;流式細胞儀檢測細胞周期;劃痕實驗和Transwell小室檢測細胞遷移和侵襲能力。
  7、體內(nèi)實驗:將5637-GFP-LC3/sh-CTRL、5637-GFP-LC3/sh-OGT和5637-GFP-LC3/sh-OGA細胞株,RT4-GFP-LC3/sh-CTRL、RT4-GFP-LC3/sh-OGT和RT4-GFP-LC3/sh-OGA細胞株分別皮下接種裸鼠

7、,觀察裸鼠及腫瘤生長情況,免疫組化檢測腫瘤中糖基化、自噬等相關(guān)基因表達,同時關(guān)注肝、肺等轉(zhuǎn)移情況。
  研究結(jié)果:
  1、使用O-GlcNAc糖基化抑制劑處理膀胱癌細胞5637、RT4后,熒光顯微鏡觀察到細胞自噬增加,Western blot檢測到自噬相關(guān)蛋白的增加;反之,使用O-GlcNAc糖基化增強劑處理膀胱癌細胞5637、RT4后,熒光顯微鏡觀察到細胞自噬減少,Western blot檢測到自噬相關(guān)蛋白的減少。

8、>  2、使用基因修飾的方法抑制細胞O-GlcNAc糖基化,熒光顯微鏡觀察到細胞自噬增加,Western blot檢測到自噬相關(guān)蛋白的增加;反之,使用基因修飾的方法增強細胞O-GlcNAc糖基化,熒光顯微鏡觀察到細胞自噬減少,Western blot檢測到自噬相關(guān)蛋白的減少。
  3、將自噬相關(guān)基因ULK1質(zhì)粒轉(zhuǎn)入細胞株,Western blot檢測到ULK1尤其是p-ULK1(S555)在細胞自噬中起重要作用。使用不同方法調(diào)節(jié)細

9、胞O-GlcNAc糖基化,Western blot檢測到p-ULK1(S555)的變化。
  4、使用不同方法調(diào)節(jié)細胞O-GlcNAc糖基化,Western blot檢測發(fā)現(xiàn):O-GlcNAc糖基化降低后,AMPK活性增加,ULK1活性增加,細胞自噬增強;反之,O-GlcNAc糖基化增加后,AMPK活性降低,ULK1活性降低,細胞自噬減弱。Co-IP實驗顯示:O-GlcNAc糖基化直接對AMPK修飾而發(fā)揮作用。
  5、成功

10、構(gòu)建AMPK缺失和過表達的細胞株,Western blot檢測到:p-ULK1(S555)的表達受AMPK調(diào)控,在AMPK缺如的情況下O-GlcNAc糖基化變化未引起p-ULK1(S555)的改變。
  6、MTT和平板克隆形成實驗示:低O-GlcNAc糖基化導(dǎo)致膀胱癌細胞增殖活力降低,高O-GlcNAc糖基化導(dǎo)致細胞增殖活力增強。流式細胞儀檢測發(fā)現(xiàn):低O-GlcNAc糖基化導(dǎo)致細胞G1期增加,G2/M期減少;高O-GlcNAc糖

11、基化導(dǎo)致細胞G1期減少,G2/M期增加。細胞劃痕實驗和Transwell小室檢測示:低O-GlcNAc糖基化導(dǎo)致膀胱癌細胞遷移和侵襲能力下降,高O-GlcNAc糖基化導(dǎo)致細胞遷移和侵襲能力增強。
  7、裸鼠皮下成瘤實驗示:與對照相比,低O-GlcNAc糖基化組皮下移植瘤的體積和重量下降,高O-GlcNAc糖基化組皮下移植瘤的體積和重量增加;低O-GlcNAc糖基化組中遠處轉(zhuǎn)移下降,高O-GlcNAc糖基化組中遠處轉(zhuǎn)移增加。另外,

12、免疫熒光證實低O-GlcNAc糖基化組中自噬增加,高O-GlcNAc糖基化組中自噬減少。
  研究結(jié)論:
  1、膀胱癌細胞中O-GlcNAc糖基化降低后,細胞自噬流增加;反之,O-GlcNAc糖基化增加后,細胞自噬流減少。即膀胱癌細胞中O-GlcNAc糖基化反向調(diào)節(jié)細胞自噬。
  2、自噬相關(guān)基因ULK1在自噬過程中起重要作用。膀胱癌細胞中O-GlcNAc糖基化降低后,AMPK活性增加,ULK1活性增加,細胞自噬增強

13、;反之,O-GlcNAc糖基化增加后,AMPK活性降低,ULK1活性降低,細胞自噬減弱。即O-GlcNAc糖基化通過AMPK途徑調(diào)節(jié)ULK1活性,而對細胞自噬產(chǎn)生影響。
  3、體外和體內(nèi)實驗證實O-GlcNAc糖基化對膀胱癌細胞生物學(xué)行為產(chǎn)生明顯的影響:低O-GlcNAc糖基化抑制膀胱癌細胞增殖活力,高O-GlcNAc糖基化增強細胞增殖活力;低O-GlcNAc糖基化抑制膀胱癌細胞侵襲與轉(zhuǎn)移能力,高O-GlcNAc糖基化增強細胞侵

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