霍亂毒素抑制人膀胱癌細(xì)胞侵襲的作用及分子機(jī)制研究.pdf

1、膀胱癌是人類泌尿系最常見的惡性腫瘤。目前，對于侵襲性膀胱癌仍沒有有效的治療手段，雖然采取手術(shù)切除、放療和化療的治療方法，但是患者的預(yù)后并不樂觀。而且現(xiàn)在臨床常用的復(fù)合化療方案MVAC(氨甲蝶呤+長春新堿+多柔霉素+順鉑)，對患者的毒性非常大。尋找新的能夠抑制膀胱侵襲的藥物，是膀胱癌治療研究的關(guān)鍵。完整的細(xì)胞骨架是細(xì)胞運(yùn)動和侵襲的先決條件。微管是細(xì)胞骨架的重要組成部分。影響微管穩(wěn)定性和完整性的藥物在低于細(xì)胞毒的劑量下就能明顯下調(diào)細(xì)胞的運(yùn)動

2、和侵襲能力。本實驗室早期研究發(fā)現(xiàn)，霍亂毒素可使短梭形，胞突較短的惡性膠質(zhì)瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)變?yōu)樾“w，多細(xì)絲狀突起的正常膠質(zhì)樣細(xì)胞。提示，霍亂毒素可能引起腫瘤細(xì)胞的骨架改變。
　　 本研究發(fā)現(xiàn)霍亂毒素可誘導(dǎo)膀胱癌細(xì)胞形態(tài)發(fā)生類似改變，并檢測到藥物導(dǎo)致細(xì)胞骨架破壞，侵襲能力明顯下降。另外，我們確定了微管相關(guān)蛋白(MAP4)是膀胱癌細(xì)胞維持微管骨架穩(wěn)定和侵襲能力的必要因子，而霍亂毒素能明顯提高M(jìn)AP4的磷酸化水平。我們推測霍亂毒素通過磷酸化M

3、AP4蛋白，使其失去穩(wěn)定微管的作用，從而使微管骨架破壞和細(xì)胞侵襲能力下降。我們的工作為膀胱癌的侵襲性研究和治療提供了理論成果，并為臨床膀胱癌治療提供了新的靶點和藥物。本研究分為四個部分：
　　 第一章：霍亂毒素對人膀胱癌細(xì)胞形態(tài)和骨架的影響。
　　 實驗室前期的工作發(fā)現(xiàn)生物毒素霍亂毒素能誘導(dǎo)惡性膠質(zhì)瘤細(xì)胞形態(tài)改變與分化。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)霍亂毒素可誘導(dǎo)膀胱癌細(xì)胞形態(tài)發(fā)生類似改變，并引起明顯的微管和微絲骨架的破壞。
　　

4、 方法：人膀胱移行細(xì)胞癌T24和UM-UC-3細(xì)胞株的培養(yǎng)；相差顯微鏡(phasecontrast microscopy)觀察細(xì)胞形態(tài)，細(xì)胞免疫熒光方法和激光共聚焦顯微鏡觀察細(xì)胞骨架的變化；Western blottingting法檢測微管的聚合和解聚狀態(tài)以及穩(wěn)定型微管蛋白acetylated-tubulin水平；定量實驗結(jié)果以(-x)±S表示，采用方差分析檢驗。
　　 結(jié)果：霍亂毒素可以引起人膀胱移行細(xì)胞癌T24和UM-UC

5、-3細(xì)胞株出現(xiàn)顯著的形態(tài)學(xué)變化，激光共聚焦顯微鏡confocal及western blotting結(jié)果顯示霍亂毒素可破壞細(xì)胞微管結(jié)構(gòu)和抑制微管聚合，并可被低劑量的紫杉醇預(yù)處理逆轉(zhuǎn)；confocal結(jié)果同時顯示霍亂毒素可破壞細(xì)胞微絲結(jié)構(gòu)，推測為微管結(jié)構(gòu)破壞的伴隨變化。
　　 結(jié)論：霍亂毒素可誘導(dǎo)膀胱癌細(xì)胞形態(tài)發(fā)生改變，并主要引起微管骨架破壞。
　　 第二章：霍亂毒素對人膀胱癌細(xì)胞存活和侵襲能力的影響。
　　 Tra

6、nswell小室模型是檢測細(xì)胞遷移和侵襲能力的最為常用的體外模型。我們在實驗中發(fā)現(xiàn)，霍亂毒素對人膀胱癌細(xì)胞株的侵襲和遷移能力有明顯的抑制作用。通過排除霍亂毒素對細(xì)胞活性的影響或損傷作用，并排除細(xì)胞黏附分子和蛋白酶類的作用，證明霍亂毒素是通過破壞膀胱癌細(xì)胞的微管骨架從而抑制細(xì)胞的侵襲和遷移。
　　 方法：永生化的非致瘤人膀胱上皮細(xì)胞SV-HUV-1細(xì)胞株的培養(yǎng)；甲基偶氮唑藍(lán)比色(3-(4,5-dimethylthiazol-2-y

7、1)-2,5-diphenyl tetrazolium bromide，MTT)法檢測細(xì)胞增殖能力；乳酸脫氫酶(1actate dehydrogenase，LDH)法檢測細(xì)胞毒性；雙醋酸熒光素FDA染色檢測細(xì)胞存活情況；Transwell小室法檢測侵襲能力；劃痕實驗法檢測遷移能力；Western blotting檢測MMP2,MMP9,Integrin-β，E-cadherin,uPA的蛋白水平；ELISA試劑盒檢測MMP2,MMP9的

8、酶活性。定量實驗結(jié)果以(-x)±S表示，采用方差分析檢驗。
　　 結(jié)果：霍亂毒素呈時間和劑量依賴性地抑制T24和UM-UC-3細(xì)胞的活性，但對非致瘤的膀胱上皮細(xì)胞細(xì)胞無抑制作用。在觀察時間內(nèi)，霍亂毒素對以上三種細(xì)胞均不引起明顯的損傷或凋亡。Transwell小室檢測及劃痕實驗及結(jié)果顯示霍亂毒素可抑制人膀胱癌細(xì)胞株的遷移及侵襲?；魜y毒素對細(xì)胞黏附分子和蛋白酶類的蛋白水平或活性沒有明顯影響，推斷霍亂毒素通過破壞膀胱癌細(xì)胞的微管骨架從

9、而抑制細(xì)胞的侵襲和遷移。
　　 結(jié)論：霍亂毒素通過非細(xì)胞毒作用，破壞膀胱癌細(xì)胞的微管骨架從而抑制細(xì)胞的侵襲和遷移。
　　 第三章：霍亂毒素引起人膀胱癌細(xì)胞侵襲能力下降和微管骨架破壞的機(jī)制的探討。
　　 霍亂毒素影響骨架的機(jī)制雖有報道且多種多樣，但對于它在膀胱癌細(xì)胞上對微管骨架的影響還不得而知，而且關(guān)于霍亂毒素抑制癌細(xì)胞侵襲的機(jī)制也尚未見報道。本章旨在闡明霍亂毒素引起人膀胱癌細(xì)胞侵襲能力下降和微管骨架破壞的機(jī)制，尋

10、找直接影響骨架變化和侵襲能力下降的靶標(biāo)分子。
　　 方法：干擾RNA(siRNA)技術(shù)研究MAP4蛋白對維持微管骨架穩(wěn)定性和侵襲能力的作用以及cAMP/PKA通路對細(xì)胞骨架和侵襲能力的影響；CO-IP和Western blotting法檢測霍亂毒素對微管相關(guān)蛋白4(MAP4)和促微管解聚蛋白Stathmin的影響；Pull-down方法檢測小G蛋白的活性；定量實驗結(jié)果以(-x)±S表示，采用方差分析檢驗。
　　 結(jié)果：F

11、orskolin和雙丁酰環(huán)腺苷酸(dbcAMP)等cAMP水平升高劑具有霍亂毒素類似的破壞微管和侵襲能力的作用。干擾PKA的活性后，霍亂毒素的上述作用被取消。干擾MAP4后出現(xiàn)類似于霍亂毒素的作用?；魜y毒素呈PKA依賴性引起MAP4蛋白磷酸化水平升高，但不影響MAP4與Stathmin的蛋白水平?；魜y毒素對小G蛋白Rho家族的活性無明顯影響。
　　 結(jié)論：霍亂毒素是通過cAMP/PKA依賴的信號通路磷酸化MAP4蛋白，從而影響細(xì)

12、胞骨架和侵襲能力的。MAP4是控制細(xì)胞骨架和侵襲能力的重要靶分子。
　　 第四章：阿司匹林對胰腺癌細(xì)胞增殖和吉西他濱敏感性的影響及其機(jī)制研究。
　　 迄今，很多研究表明阿司匹林(乙酰水楊酸)對胰腺癌有明顯的生長抑制作用，但是具體的機(jī)制還不完全清楚。另外，阿司匹林對腫瘤細(xì)胞的耐藥性的影響也是頗受爭議的。本章就阿司匹林對胰腺癌細(xì)胞增殖和對吉西他濱敏感性的影響兩個問題進(jìn)行探討。
　　 方法：人源胰腺癌細(xì)胞株P(guān)ANC-1

13、和Capan-1的培養(yǎng)；MTT，LDH，Annexin-V,Hoechst33258檢測細(xì)胞的活性，凋亡和損傷；流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞周期；特異性的磷酸化抗體檢測某些蛋白的活化形式；RT-PCR檢測CyclinD l和Bcl-2的轉(zhuǎn)錄情況。
　　 結(jié)果：單用阿司匹林呈時效和量效依賴性地抑制胰腺癌細(xì)胞的增殖，主要是通過誘導(dǎo)細(xì)胞周期阻滯在G1期；阿司匹林可以促進(jìn)吉西他濱對細(xì)胞的殺傷作用，但本身不引起細(xì)胞凋亡或者損傷；阿司匹林能夠抑制胰腺