巴弗洛霉素A1實驗治療兒童b-急性淋巴細(xì)胞白血病.pdf

1、目的:
　　B細(xì)胞急性淋巴細(xì)胞白血病(B-ALL)是最常見的兒童白血病。目前兒童B細(xì)胞急性淋巴細(xì)胞白血病的治療方案往往與中樞神經(jīng)系統(tǒng)的副作用和復(fù)發(fā)有關(guān)。因此，需要更有效、更安全的藥物。Bafilomycin A1(Baf-A1)是一種大環(huán)內(nèi)酯類抗生素，已用于臨床治療索氏梭菌引起的敗血癥，但尚未見于實體瘤的臨床治療應(yīng)用，也未見于白血病的治療研究。本課題旨在研究Baf-A1對B-ALL的實驗治療作用，并探討其作用機制，為其研發(fā)成為B-

2、ALL靶向治療新藥提供臨床前實驗研究數(shù)據(jù)和理論依據(jù)。具體目標(biāo):(1)明確Baf-A1對B-ALL細(xì)胞的特異性殺傷作用;(2)確定Baf-A1對B-ALL動物模型的治療作用;(3)明確Baf-A1靶向B-ALL患者原代細(xì)胞的臨床意義;(4)探索Baf-A1實驗治療B-ALL的分子機制。
　　方法:
　　首先，通過CCK8檢測Baf-A1對B-ALL細(xì)胞生長的影響，流式CFSE檢測對細(xì)胞增殖的影響，流式PI檢測對細(xì)胞周期的影響，

3、流式PI/AnnexinⅤ雙染檢測對細(xì)胞凋亡的影響等，確定體外細(xì)胞水平Baf-A1對B-ALL的抑制作用。
　　其次，通過CCK8檢測Baf-A1對B-ALL患者原代細(xì)胞生長的影響，以及流式PI/AnnexinⅤ雙染檢測對患者原代細(xì)胞凋亡的影響，確定Baf-A1抑制B-ALL的臨床意義。
　　然后，建立B-ALL小鼠模型。4周齡雄性NOD/SCID小鼠飼養(yǎng)于SPF動物房。將處于指數(shù)生長期的標(biāo)記了GFP的697細(xì)胞（5～10×

4、106個細(xì)胞/0.2 ml）經(jīng)尾靜脈注射到NOD/SCID小鼠體內(nèi)。觀察小鼠體重、飲食和活動性等情況變化，第四周處死NOD/SCID小鼠。B-ALL小鼠模型成功建立的評定標(biāo)準(zhǔn):a）體重、活動量、飲食水量下降;b）出現(xiàn)肢體癱瘓小鼠;c）外周血、骨髓中白細(xì)胞數(shù)量和比率升高，血涂片可見大量幼稚細(xì)胞;d）肝、脾、胃等組織有大量白細(xì)胞浸潤;e）血液和骨髓中能檢測出E2A/Pbx1融合基因表達(dá)。
　　在成功建?；A(chǔ)上，研究Baf-A1對B-A

5、LL小鼠的治療效果。NOD/SCID小鼠分為四組:對照組(C)、發(fā)病組(M)、治療組1(T1)和治療組2(T2)。治療組注射697細(xì)胞一周后再注射Baf-A1。其中，治療組1:NOD/SCID小鼠腹腔注射0.1 mg/kg Baf-A1。治療組2:NOD/SCID小鼠腹腔注射1 mg/kg Baf-A1。同時，對照組和發(fā)病組:NOD/SCID小鼠注射生理鹽水。所有各組均每天一次，連續(xù)3天給藥。治療效果的評定標(biāo)準(zhǔn):a）延長小鼠生存時間;b

6、）降低出現(xiàn)肢體癱瘓小鼠的比率;c）緩解白血病細(xì)胞對組織的浸潤; d）外周血象、骨髓象恢復(fù)。
　　此外，我們使用C57BL/6J小鼠為模型初步進(jìn)行了毒力測定。將小鼠分為6組，分別給予注射不同濃度的Baf-A1:0.1、1、5、10、25 mg/kg，同時將1組設(shè)為對照組給予注射相應(yīng)劑量的乙醇（Baf-A1的溶劑）。注射兩周后沒有小鼠發(fā)生死亡。每隔一天稱量一次體重。在注射Baf-A1后的第14天將小鼠全部處死，取外周血細(xì)胞做血象分析，

7、取各組織做比重分析，取肝組織做病理觀察。
　　進(jìn)而，我們通過免疫印跡、成像流式分析、共聚焦成像、siRNA干擾等實驗手段，初步探索了Baf-A1特異性殺傷B-ALL細(xì)胞的分子機制。
　　結(jié)果:
　　一、Baf-A1特異性抑制B-ALL細(xì)胞系增殖，而對髓系白血病細(xì)胞和正常骨髓細(xì)胞的生長和活性沒有明顯影響。對白血病小鼠模型的研究表明，Baf-A1可以有效治療B-ALL，降低死亡率，減弱白血病細(xì)胞對肝、脾的浸潤。C57小鼠體

8、內(nèi)毒性試驗表明，治療劑量下的Baf-A1是安全的。Baf-A1的選擇性殺傷作用在B-ALL患者原代細(xì)胞上也獲得證實。
　　二、Baf-A1是H+-ATPase酶的抑制劑，在高濃度下，常用于抑制晚期自噬。在本課題研究中，我們首次發(fā)現(xiàn)Baf-A1在低濃度(1 nM)下除了能夠通過抑制自噬體和溶酶體的融合從而抑制晚期自噬之外，還能通過激活mTOR信號通路，并通過干擾Beclin1-Vps34復(fù)合體的形成，抑制早期自噬途徑。
　　三