外源性透明質(zhì)酸對骨髓來源間充質(zhì)干細胞體外定向分化的誘導效應研究.pdf

1、第一部分，目的:優(yōu)化獲取兔骨髓間充質(zhì)干細胞方法，并對細胞進行純化、鑒定及擴增，同時對其生物學性狀進行研究。
　　 方法:取新生新西蘭大耳白兔骨髓5.0ml，采用密度梯度離心法、貼壁篩選法并結(jié)合傳代對其進行純化，觀察細胞形態(tài)和表面標志物的表達，從而對其進行鑒定。觀察第1、3、5、7代細胞的增殖情況，并繪制出生長曲線。
　　 結(jié)果:經(jīng)密度梯度離心、貼壁篩選并結(jié)合細胞傳代均可得到貼壁細胞集落，密度梯度離心集落形成率稍高，但貼壁

2、篩選法操作更簡便。傳代至第3代和第5代細胞形態(tài)單一，細胞排列具有典型的漩渦狀結(jié)構(gòu)。第1、3、5代細胞增殖能力強，生長旺盛;至第7代細胞增殖明顯減弱。所分離培養(yǎng)的細胞表達CD44、CD90，不表達CD34。
　　 結(jié)論:分離培養(yǎng)的細胞為間充質(zhì)干細胞，且成份單一，具有多向分化潛能，且無造血系干細胞標志。經(jīng)體外傳代，增殖能力強，適宜作為種子細胞進行下一步研究。
　　 第二部分，外源性透明質(zhì)酸對MSCs增殖及分化情況的影響

3、>　　 目的:通過研究外源性透明質(zhì)酸(hyaluronicacid，HA)對兔骨髓間充質(zhì)干細胞(Mesenchymalstemcells，Mscs)體外增殖及定向分化為軟骨細胞的影響，探討關節(jié)腔內(nèi)環(huán)境對Mscs的作用，為Mscs為基礎的組織工程化軟骨的臨床應用奠定基礎。
　　 方法:全骨髓法+貼壁培養(yǎng)法分離培養(yǎng)兔Mscs，取第4代細胞用于實驗，實驗組細胞加入HA誘導液(含0.25mg/mlHA+含10％FBS的HG-DMEM)

4、，以TGF-β3誘導組作為陽性對照，陰性對照組加入常規(guī)培養(yǎng)液。分別于誘導后第7、14、21d行甲苯胺藍染色檢測蛋白聚糖表達，免疫組化染色及RT-PCR檢測細胞Ⅱ型膠原表達。
　　 結(jié)果:經(jīng)HA誘導后，細胞增殖速度減慢，由長梭形變?yōu)槎嘟切?、橢圓形，細胞外基質(zhì)呈甲苯胺藍異染性和Ⅱ型膠原免疫組化陽性，RT-PCR檢測示Ⅱ型膠原mRNA表達陽性，表現(xiàn)出軟骨細胞的分化特點，但表達均比陽性對照組弱。
　　 結(jié)論:外源性HA具有誘導兔

5、Mscs向軟骨細胞分化的能力，但比TGF-β3的誘導能力弱。提示關節(jié)腔內(nèi)環(huán)境對Mscs向軟骨細胞分化有正性促進作用，支持HA作為軟骨組織工程基質(zhì)使用。
　　 第三部分，不同濃度透明質(zhì)酸對骨髓來源間充質(zhì)干細胞成軟骨分化的影響
　　 目的:探討不同濃度透明質(zhì)酸對骨髓來源間充質(zhì)干細胞向軟骨方向定向分化的影響。
　　 方法:取P3代未誘導的骨髓來源間充質(zhì)干細胞，按培養(yǎng)液中添加的透明質(zhì)酸濃度不同分為兩實驗組，A組:低濃度組

6、(基礎培養(yǎng)基+HA0.1mg/ml)，B組:高濃度組(基礎培養(yǎng)基+HA0.2mg/ml)。同時設立空白對照組（基礎培養(yǎng)基）及陽性對照組（基礎培養(yǎng)基+10ng/mlTGF-β3），觀察細胞形態(tài)，增殖情況并繪制生長曲線，分別于誘導后第7、14、21d行免疫組化染色及RT-PCR檢測細胞Ⅱ型膠原表達。
　　 結(jié)果:經(jīng)添加軟骨誘導劑后，干細胞細胞增殖速度放緩，形態(tài)由長梭形變?yōu)槎嘟切巍E圓形，胞漿Ⅱ型膠原免疫組化陽性，RT-PCR檢測示Ⅱ

7、型膠原mRNA表達陽性，表現(xiàn)出軟骨細胞的分化特點，半定量分析顯示兩實驗組Ⅱ型膠原表達無差異，但均比陽性對照組弱，空白對照組無Ⅱ型膠原表達。
　　 結(jié)論:不同濃度外源性HA誘導兔Mscs向軟骨細胞分化的能力無差異，且均比TGF-β3的誘導能力弱。提示HA作為細胞外基質(zhì)的主要成分，有促進Mscs向軟骨細胞分化的作用，但改變外環(huán)境中透明質(zhì)酸濃度不會影響Mscs的軟骨分化。自體關節(jié)腔內(nèi)環(huán)境支持以干細胞為基礎的組織工程化軟骨修復軟骨缺損。

8、
　　 第四部分，不同分子量透明質(zhì)酸對骨髓來源間充質(zhì)干細胞成軟骨分化的影響
　　 目的:探討不同分子量透明質(zhì)酸對骨髓來源間充質(zhì)干細胞向軟骨方向定向分化的影響。
　　 方法:取P3代未誘導的骨髓來源間充質(zhì)干細胞，培養(yǎng)液中分別添加不同分子量透明質(zhì)酸做誘導劑，分為三個實驗組，A組:低分子量組(基礎培養(yǎng)基+HA0.1mg/ml，平均分子量約1000kD)，B組:中分子量組(基礎培養(yǎng)基+HA0.1mg/ml，平均分子量約1

9、800kD)，高分子量組(基礎培養(yǎng)基+HA0.1mg/ml，平均分子量約2000kD)。同時設立空白對照組（基礎培養(yǎng)基）及陽性對照組（基礎培養(yǎng)基+10ng/mlTGF-β3），觀察細胞形態(tài)，增殖情況并繪制生長曲線，分別于誘導后第7、14、21d行甲苯胺藍染色檢測蛋白聚糖表達，另外采用免疫組化染色及RT-PCR方法檢測細胞Ⅱ型膠原表達。
　　 結(jié)果:經(jīng)添加軟骨誘導劑后，干細胞細胞增殖速度放緩，形態(tài)由長梭形變?yōu)槎嘟切?、橢圓形，細胞外

10、基質(zhì)呈甲苯胺藍異染性，胞漿Ⅱ型膠原免疫組化陽性，RT-PCR檢測示Ⅱ型膠原mRNA表達陽性，表現(xiàn)出軟骨細胞的分化特點，半定量分析顯示實驗組Ⅱ型膠原表達與對照組有差異，但B、C組間Ⅱ型膠原表達相似，空白對照組無Ⅱ型膠原表達。
　　 結(jié)論:不同分子量外源性HA誘導兔Mscs向軟骨細胞分化的能力存在差異，分子量高的HA的誘導能力較低分子量HA的誘導能力強。證明透明質(zhì)酸的分子量與Mscs的軟骨分化有關聯(lián)性，但均比TGF-β3的誘導能力弱

11、。提高關節(jié)腔內(nèi)透明質(zhì)酸分子量對干細胞為基礎的組織工程化軟骨修復軟骨缺損有幫助。
　　 第五部分，外源性透明質(zhì)酸誘導骨髓間充質(zhì)干細胞修復兔膝關節(jié)軟骨缺損的研究
　　 目的:探討外源性透明質(zhì)酸(hyaluronicacid，HA)誘導的骨髓間充質(zhì)干細胞(mesenchymalstemcells，MSCs)對全層軟骨缺損修復的效果，了解體內(nèi)條件下經(jīng)外源性透明質(zhì)酸誘導的干細胞能否保持軟骨分化表型，促進軟骨修復。
　　 方

12、法:4月齡日本大耳白兔24只，用手搖鉆制成直徑5mm、深4mmm的圓柱形膝關節(jié)軟骨缺損。分四組分別植入藻酸鹽凝膠混合的經(jīng)透明質(zhì)酸誘導后兔骨髓間充質(zhì)干細胞（組A，n=6），藻酸鹽凝膠混合的未經(jīng)誘導的兔骨髓間充質(zhì)干細胞（組B，n=6），單純藻酸鹽凝膠組（組C，n=6），及缺損處不處理(組D，n=6)。術(shù)后5、8和12周觀察軟骨缺損修復情況，進行組織學評分。HE染色觀察軟骨細胞情況，RT-PCR檢測修復組織中Ⅱ型膠原mRNA合成情況。

13、　　 結(jié)果:術(shù)后第8周，A組及B組與其他組比較，缺損處軟骨充填較好，與正常軟骨結(jié)合緊密，融合良好，組織學評分有差異，但A組與B組間評分無差異。至第12周，可見A組及B組關節(jié)面平滑，結(jié)合緊密，與周圍軟骨結(jié)合良好，移植物界限基本消失。大體評分A組、B組均優(yōu)于其他組，且A組與B組間差異有顯著性。組織學觀察顯示，修復組織A組類似透明軟骨，B組接近纖維軟骨，C組與D組細胞以纖維組織為主。PCR檢測僅在A、B兩組中見Ⅱ型膠原mRNA合成，且A組R