重癥開放性眼球損傷視網(wǎng)膜病變及機(jī)制實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、[背景]
　　隨著社會(huì)的發(fā)展和交通事故的增加，開放性眼球損傷的發(fā)生率逐年提高，而其中有2/3合并后極部視網(wǎng)膜損傷。在現(xiàn)代化戰(zhàn)爭(zhēng)中，眼部戰(zhàn)創(chuàng)傷中開放性眼球損傷中合并后極部視網(wǎng)膜損傷的病例也高達(dá)80-90％。引起職業(yè)性球內(nèi)異物傷的原因最常見是捶打金屬時(shí)飛濺的金屬碎屑打擊進(jìn)入眼球。這與戰(zhàn)時(shí)爆炸碎片所致眼內(nèi)異物傷的致傷原理相似，都是飛行異物打擊眼球引起。開放性眼球損傷常合并眼內(nèi)容物流失，和后極部視網(wǎng)膜損傷嚴(yán)重，稱為重癥開放性眼球損傷，其預(yù)

2、后差，致盲率高。重癥開放性眼球損傷導(dǎo)致視功能障礙的機(jī)制及影響其預(yù)后的因素已成為研究的熱點(diǎn)。目前認(rèn)為影響重癥開放性眼球損傷預(yù)后因素主要與視網(wǎng)膜的損傷有關(guān)，但對(duì)傷后視網(wǎng)膜改變的研究很少。合適的動(dòng)物模型，和開放性眼球損傷后視網(wǎng)膜病變對(duì)視功能的影響都有待進(jìn)一步研究。
　　為此，本實(shí)驗(yàn)采用自制氣槍建立重癥開放性眼球損傷模型，對(duì)其病理學(xué)變化改變進(jìn)行觀測(cè)，以視覺電生理(F-ERG)作為評(píng)價(jià)兔眼傷后視功能的指標(biāo)，并通過(guò)對(duì)視網(wǎng)膜凋亡因素的觀察，探討

3、兔眼破裂傷后視網(wǎng)膜光感受細(xì)胞損傷機(jī)制，為臨床上研究重癥開放性眼球損傷治療提供理論病理依據(jù)。
　　[目的]
　　開放性眼球損傷常造成嚴(yán)重視力下降或視力喪失，損傷機(jī)制尚不十分清楚。本研究利用氣槍制做重癥開放性眼球損傷模型，觀察兔眼破裂傷后視網(wǎng)膜早期臨床表現(xiàn)、病理變化以及光感受細(xì)胞損傷機(jī)制。
　　[方法]
　　1、健康無(wú)眼疾新西蘭白兔48只。隨機(jī)分為正常對(duì)照、傷后1h、3h、6h、12h、24h共6組，每組8只。麻醉后

4、，用自制氣槍自角膜緣后向球內(nèi)射擊，形成重癥開放性眼球損傷動(dòng)物模型。
　　2、于傷后1h、3h、6h、12h、24h時(shí)行傷眼視覺誘發(fā)電位檢查，評(píng)估視功能損傷后處死實(shí)驗(yàn)兔，立即摘除眼球，行石蠟包埋。將包埋好的眼球標(biāo)本，平行于視神經(jīng)矢狀軸且以其為平面的視網(wǎng)膜進(jìn)行連續(xù)切片，后行HE染色、甲基綠-派羅寧-馬休黃(MG-P-MY)染色法行細(xì)胞RNA檢測(cè)、p53、bcl-2、細(xì)胞原位凋亡檢測(cè)。
　　3、HE染色組織切片行光鏡及超高倍顯微鏡

5、觀察(ACT-2000型超高倍顯微診斷系統(tǒng))。光鏡下觀察:RNA檢測(cè)、TUNEL法細(xì)胞凋亡、p53和bcl-2蛋白陽(yáng)性表達(dá)圖像經(jīng)過(guò)高清晰彩色病理圖像分析系統(tǒng)(HPISA-1000)處理，定量分析視網(wǎng)膜組織中p53、bcl-2的表達(dá)及細(xì)胞凋亡情況。應(yīng)用SPSS10.0統(tǒng)計(jì)軟件，進(jìn)行變量轉(zhuǎn)換，單因素方差分析和相關(guān)分析等統(tǒng)計(jì)學(xué)方法處理。
　　[結(jié)果]
　　1、臨床表現(xiàn)射釘擊傷兔眼后見傷眼結(jié)膜立即充血、水腫、角膜傷口可見房水溢出，虹

6、膜、晶體脫出，隨后15秒至1分鐘發(fā)生眼球內(nèi)出血自傷口處溢出。
　　2、眼電生理結(jié)果正常8只兔眼視網(wǎng)膜電圖b波振幅為103.5±16.841mv，實(shí)驗(yàn)組1h、3h、6h、12h、24h所有傷眼ERG檢查b波振幅消失，呈熄滅型波型。
　　3、病理檢查HE染色光鏡及超高倍顯微鏡觀察:所有傷眼可見脈絡(luò)膜上腔出血，玻璃體內(nèi)可見大量紅細(xì)胞，視網(wǎng)膜脫離，偶見淺層鞏膜出血、睫狀體與鞏膜分離。1h～3h時(shí)視網(wǎng)膜感光細(xì)胞的錐桿層有碎裂改變，其它

7、結(jié)構(gòu)無(wú)明顯改變。6h～12h時(shí)視網(wǎng)膜內(nèi)、外核層明顯空泡變性，神經(jīng)節(jié)細(xì)胞核少量固縮等明顯改變。24h時(shí)視網(wǎng)膜變薄、結(jié)構(gòu)紊亂不清。
　　4、MG-P-MY染色檢測(cè)細(xì)胞RNA表達(dá)情況對(duì)照組和1h組視網(wǎng)膜各層細(xì)胞內(nèi)均未見RNA陽(yáng)性表達(dá)，3h組在內(nèi)核層及神經(jīng)節(jié)細(xì)胞層有少量RNA陽(yáng)性表達(dá)，6h內(nèi)核層陽(yáng)性表達(dá)增多，外核層偶見陽(yáng)性表達(dá)，12h陽(yáng)性表達(dá)明顯，24h可見大量RNA陽(yáng)性細(xì)胞。凋亡指數(shù)(AIP)統(tǒng)計(jì)結(jié)果示對(duì)照組與傷后1h組差別有顯著性(P

8、=0.033);傷后1h與3h組差別有顯著性(P=0.042);傷后12h與24h組比較無(wú)顯著性差別(P=0.570);其它各組之間比較有顯著性差異(P＜0.01)。
　　5、超高倍鏡下觀察對(duì)照組和1h組未見腫脹壞死細(xì)胞，3h時(shí)出現(xiàn)腫脹壞死細(xì)胞，6h腫脹壞死細(xì)胞數(shù)達(dá)高峰，12h組有所下降。各實(shí)驗(yàn)組脹亡指數(shù)比較:對(duì)照組與1h組差別無(wú)顯著性(P=0.470)，1h組與24h組差別無(wú)顯著性(P=0.064)，3h與12h組差別無(wú)顯著性(

9、P=0.141);對(duì)照組與24h組（P=0.12）、3h與24h組（P=0.08）差別無(wú)顯著性，其它各組之間比較有顯著性差異(P＜0.01)。
　　6、凋亡細(xì)胞(RNA陽(yáng)性)和腫脹壞死細(xì)胞的比較從其各占細(xì)胞總數(shù)的比例來(lái)看，在受傷6h以前(含6h)脹亡細(xì)胞所占的比例大于凋亡細(xì)胞;在受傷12h以后（含12h）凋亡細(xì)胞所占的比例要大于脹亡細(xì)胞，而且隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，腫脹壞死細(xì)胞有下降趨勢(shì)，而凋亡細(xì)胞在12h后雖小幅升高但趨于穩(wěn)定。

10、　　7、免疫組織化學(xué)對(duì)照組及各實(shí)驗(yàn)組bcl-2均無(wú)明顯表達(dá)。p53在3h開始在內(nèi)、外核層及神經(jīng)節(jié)細(xì)胞層有少量陽(yáng)性表達(dá)，6h～12h明顯增多，24h略有下降。細(xì)胞凋亡6h在神經(jīng)節(jié)細(xì)胞和內(nèi)、外核層有少量表達(dá)，12h-24h染色陽(yáng)性的細(xì)胞明顯增多。本試驗(yàn)中:Bcl-2對(duì)照組與實(shí)驗(yàn)各組差異均無(wú)顯著性（P＞0.05）;正常視網(wǎng)膜組織細(xì)胞未見p53表達(dá)，對(duì)照組與傷后1h組差別無(wú)顯著性P=0.053，與傷后3h、6h、12h、24h之間的比較差異極顯

11、著(P＜0.01);傷后6h和24hp53蛋白的表達(dá)無(wú)顯著性(p=0.807);視細(xì)胞凋亡在傷后6h出現(xiàn)，方差分析，對(duì)照組與傷后1h組差別無(wú)顯著性(P=0.062)，對(duì)照組與傷后3h差異具有顯著性(P=0.005)、與6、12、24h之間的比較有極顯著差異性(P＜0.01);傷后12h和24h細(xì)胞凋亡的陽(yáng)性表達(dá)無(wú)顯著性(P=0.628)。
　　8、細(xì)胞凋亡指數(shù)觀察對(duì)照組與傷后1h組差別無(wú)顯著性(P=0.019)，傷后1h與傷后3h

12、差異無(wú)顯著性(P=0.022)，傷后12h、24h之間的比較無(wú)顯著差異性(P=0.392);傷后3h、6h和12h細(xì)胞凋亡指數(shù)有有極顯著差異性(P＜0.01)。相關(guān)分析顯Bcl-2與p53及細(xì)胞凋亡無(wú)明顯關(guān)系，而p53與細(xì)胞凋亡存在顯著相關(guān)（P＜0.05）。
　　[結(jié)論]
　　1、本研究運(yùn)用制重癥開放性眼球損傷模型，傷情基本一致，制做簡(jiǎn)單、重復(fù)性好，便于對(duì)比研究，是理想的動(dòng)物模型。
　　2、重癥開放性眼球氣槍損傷傷情非

13、常嚴(yán)重，光鏡下視網(wǎng)膜在6h出現(xiàn)明顯病理?yè)p害，12-24h即出現(xiàn)不可逆改變。
　　3、重癥開放性眼球損傷后3h視細(xì)胞內(nèi)即有RNA表達(dá)，傷后6h視細(xì)胞內(nèi)見TUNEL陽(yáng)性細(xì)胞，視細(xì)胞內(nèi)RNA表達(dá)與視細(xì)胞凋亡密切相關(guān)，用于反映視細(xì)胞凋亡情況時(shí)較TUNEL法更早、更敏感。
　　4、MG-P-MY染色結(jié)合超高倍鏡觀察，可準(zhǔn)確分辨正常、凋亡和腫脹壞死細(xì)胞，為研究視網(wǎng)膜損傷時(shí)凋亡和腫脹壞死的情況提供了一個(gè)可靠、直觀、快速的方法。