ADMA在糖尿病視網(wǎng)膜病變早期——視網(wǎng)膜屏障損傷中的作用及機(jī)制.pdf

1、研究背景：
　　糖尿病視網(wǎng)膜病變(Diabetic Retinopathy，DR)是糖尿病最常見的微血管并發(fā)癥之一，是成人失明的重要病因。血-視網(wǎng)膜屏障損傷和血管新生是DR的主要病理特征。其中，血-視網(wǎng)膜屏障損傷不僅是非增殖性DR(DR分為非增殖性DR和增殖性DR)的重要病理特征，而且是導(dǎo)致非增殖性DR向增殖性DR轉(zhuǎn)變的關(guān)鍵步驟，因此，減輕或抑制DR血-視網(wǎng)膜屏障損傷對于DR防治非常重要。但目前仍無有效的措施干預(yù)并延緩糖尿病視網(wǎng)膜

2、微血管屏障損傷的發(fā)生發(fā)展。
　　非對稱二甲基精氨酸（Asymmetric dimethylarginine，ADMA）是內(nèi)源性一氧化氮合酶抑制物，在體內(nèi)主要由二甲基精氨酸-二甲胺水解酶(Dimethylarginine dimethylaminohydrolase，DDAH)水解。我們實驗室和國內(nèi)外其他學(xué)者均已證明在糖尿病和糖尿病血管并發(fā)癥時，ADMA水平的升高與血管內(nèi)皮功能紊亂和血管病變密切相關(guān)。然而，有關(guān)DDAH/ADMA與糖

3、尿病血管病變的研究主要集中在外周血管，是否與糖尿病微血管病變有關(guān)，報道甚少。臨床研究發(fā)現(xiàn)，DR病人血漿ADMA濃度明顯升高，且其房水中ADMA水平亦顯著增加，提示ADMA可能在DR的發(fā)生發(fā)展中起了重要作用。已知，間隙連接細(xì)胞間通迅(Gap junction intercellular communication，GJIC)功能障礙是DR血-視網(wǎng)膜屏障損傷的重要機(jī)制。間隙連接蛋白蛋白43(Connexin43，Cx43)是構(gòu)成細(xì)胞間隙連接

4、的重要成分。研究表明，高糖可抑制視網(wǎng)膜內(nèi)皮細(xì)胞和色素上皮細(xì)胞Cx43表達(dá)，導(dǎo)致GJIC功能障礙。我室前期研究表明，外源性ADMA可直接抑制內(nèi)皮細(xì)胞Cx43 mRNA表達(dá)，損傷GJIC功能?；诖耍覀兺茰y糖尿病時，ADMA可能通過干預(yù)視網(wǎng)膜周細(xì)胞Cx43表達(dá)，影響GIJC功能，進(jìn)而促進(jìn)視網(wǎng)膜微血管屏障損傷。
　　Eph受體是新發(fā)現(xiàn)的酪氨酸蛋白激酶受體家族的分支。研究報導(dǎo)，EphA2受體參與細(xì)胞透性調(diào)節(jié)。在培養(yǎng)的人腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞，

5、血管內(nèi)皮生長因子(Vascular endothelial growth factor，VEGF)可通過上調(diào)EphA2信號通路增加細(xì)胞透性。另外，研究發(fā)現(xiàn)，VEGF是DDAH的下游靶點，提示糖尿病時，DDAH/ADMA亦可能通過調(diào)節(jié)EphA2信號通路，影響視網(wǎng)膜微血管屏障功能。
　　本實驗將在Ⅰ型糖尿病大鼠模型（不同時期）上觀察ADMA在視網(wǎng)膜組織中的動態(tài)變化，確定ADMA與DR早期血-視網(wǎng)膜屏障損傷的內(nèi)在聯(lián)系;在原代培養(yǎng)的大鼠視

6、網(wǎng)膜周細(xì)胞(Retinal pericytes，RPCs)中進(jìn)一步確證DDAH/ADMA在高糖所誘導(dǎo)的血-視網(wǎng)膜屏障損傷中的作用，采用siRNA方法觀察內(nèi)、外源性ADMA是否能模擬高糖所誘導(dǎo)的血-視網(wǎng)膜屏障損傷，并進(jìn)一步探討DDAH/ADMA對血-視網(wǎng)膜屏障損傷的影響是否涉及ADMA/Cx43/GJIC途徑和/或ADMA/EphA2途徑。
　　方法：
　　單次腹腔注射(60 mg/kg) STZ建立Ⅰ型糖尿病大鼠模型。實驗隨

7、機(jī)分為正常對照組（二周、四周和八周）與糖尿病大鼠病程組（二周、四周和八周）。檢測各組大鼠體重、血糖、胰島素水平的變化，伊文思藍(lán)法檢測大鼠血-視網(wǎng)膜屏障功能，透射電鏡觀察血-視網(wǎng)膜屏障結(jié)構(gòu)的完整性;取大鼠全血，分離血漿，檢測大鼠ADMA（HPLC法）水平與NO水平（Griess法）;取大鼠房水，檢測ADMA水平（HPLC法）;熒光實時定量PCR法和蛋白質(zhì)印跡法檢測視網(wǎng)膜組織Cx43和EphA2 mRNA和蛋白表達(dá)。
　　分離、培養(yǎng)和

8、鑒定RPCs。實驗分為三部分:①葡萄糖(30 mM)處理RPCs1、3、5、7天;②外源性ADMA(3、10、30μM)、一氧化氮合酶抑制物單甲基精氨酸L-NMMA(30μM)和NO供體硝普鈉（0.1mM）處理RPCs48 h;③內(nèi)源性ADMA處理RPCs48 h(分為DDAH1 siRNA, DDAH2 siRNA, DDAH1+2 siRNA)。 Transwell小室檢測RPCs透性;Hoechst法與Caspase-3活性檢測R

9、PCs凋亡;劃痕(SDLT)法檢測RPCs GJIC功能;HPLC法檢測上清液ADMA水平;細(xì)胞免疫熒光法檢測Cx43與p-Cx43蛋白表達(dá);熒光實時定量PCR檢測RPCs DDAH、Cx43與EphA2 mRNA表達(dá);蛋白質(zhì)印跡法檢測細(xì)胞DDAH、Cx43與p-Cx43蛋白表達(dá)。
　　結(jié)果：
　?、裥吞悄虿〈笫笱欠€(wěn)定持續(xù)升高，出現(xiàn)明顯“三多”（多飲，多食和多尿）癥狀，且二周、四周和八周糖尿病大鼠的體重、血漿中胰島素水平均

10、較正常對照組顯著降低，表明建模成功。血-視網(wǎng)膜屏障功能檢測顯示，與正常對照組大鼠相比，糖尿病大鼠組視網(wǎng)膜組織通透性均顯著增加，并在八周達(dá)到高峰;同時大鼠視網(wǎng)膜外周血管相繼出現(xiàn)水腫，細(xì)胞間間隙連接不完整，基底膜增厚，RPCs數(shù)目減少和屏障結(jié)構(gòu)不完整。此外，同對照組大鼠相比，糖尿病大鼠房水與血漿中ADMA水平顯著升高，視網(wǎng)膜組織Cx43 mRNA與蛋白表達(dá)顯著下調(diào)，EphA2 mRNA表達(dá)顯著上調(diào)。
　　在原代培養(yǎng)的RPCs:①高糖可

11、時間依賴性的增加RPCs透性，誘導(dǎo)RPCs凋亡，第5天達(dá)到顯著差異，第7天更明顯;高糖可顯著增加細(xì)胞上清液ADMA水平，降低Cx43表達(dá)，抑制GJIC功能，并上調(diào)EphA2表達(dá);②外源性ADMA可時間與劑量依賴性的增加RPCs透性，誘導(dǎo)RPCs凋亡，降低Cx43 mRNA與蛋白表達(dá)并上調(diào)EphA2mRNA的表達(dá)，L-NMMA也產(chǎn)生類似的作用，NO供體（硝普鈉）可部分逆轉(zhuǎn)ADMA對RPCs的影響;③采用DDAH siRNA內(nèi)源性增加ADM