人體腸道菌群的LDR檢測(cè)分型及定量方法的研究.pdf_第1頁(yè)
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1、目的:建立穩(wěn)定、快速、高通量的人體腸道菌群定量分型方法。 方法:采集糞便標(biāo)本并抽提細(xì)菌DNA,利用通用引物擴(kuò)增細(xì)菌的16SrDNA,并進(jìn)行克隆和測(cè)序,用作待檢菌的標(biāo)準(zhǔn)品。根據(jù)細(xì)菌基因數(shù)據(jù)庫(kù),選擇球形梭菌群(Clostridium coccoides group),類(lèi)桿菌群(Bacteroides andrelated genera),柔嫩梭菌群(Clostridium,leptum group)三種腸道優(yōu)勢(shì)菌的16S rDNA序

2、列,設(shè)計(jì)相應(yīng)的連接酶檢測(cè)反應(yīng)(ligase detection reaction,LDR)探針。將三種優(yōu)勢(shì)菌的克隆標(biāo)準(zhǔn)品用紫外吸收法定量后按比例混勻,PCR擴(kuò)增16S rDNA后進(jìn)行LDR檢測(cè)其信號(hào)值,建立標(biāo)準(zhǔn)曲線。將標(biāo)準(zhǔn)品系列稀釋后進(jìn)行PCR及LDR,確定臨界值即檢測(cè)的靈敏度。將臨床分離的不同年齡和性別的50份糞便標(biāo)本,提取細(xì)菌總DNA后,經(jīng)PCR擴(kuò)增進(jìn)行16S rDNA的LDR檢測(cè),計(jì)算標(biāo)本中三種細(xì)菌的相對(duì)含量,并用SPSS軟件進(jìn)行

3、分析。 結(jié)果:利用設(shè)計(jì)的通用引物對(duì)樣本的16S rDNA進(jìn)行克隆及測(cè)序,成功建立了標(biāo)準(zhǔn)品和標(biāo)準(zhǔn)曲線,所建立的檢測(cè)方法最低可檢測(cè)到10<'-3>飛摩爾/升(fmol/L,fM)。對(duì)50份臨床收集標(biāo)本的檢測(cè)結(jié)果顯示,球形梭菌群的相對(duì)含量隨著年齡的增長(zhǎng)顯著升高(P<0.01);類(lèi)桿菌群的相對(duì)含量在年齡大于60歲后顯著升高(P<0.01),在青年和中年組間沒(méi)有差異(P>0.05);柔嫩梭菌群的相對(duì)含量在不同年齡組間均無(wú)差異(P>0.05

4、)。 三種菌群的相對(duì)含量在不同性別之間無(wú)差異(P>0.05)。各類(lèi)人群中均為球形梭菌群最高(46.5±10.8%),類(lèi)桿菌群次之(29.3±9.2%),柔嫩梭菌群最低(24.2±11.5%),其生物學(xué)原因還有待進(jìn)一步研究。 結(jié)論:用與質(zhì)粒載體連接后擴(kuò)增的克隆作標(biāo)準(zhǔn)品比直接用厭氧菌基因組DNA更簡(jiǎn)便,可以避免在苛刻條件下重復(fù)培養(yǎng)厭氧菌,并可保證后續(xù)實(shí)驗(yàn)中序列可靠、定量準(zhǔn)確。PCR和LDR技術(shù)聯(lián)合使用可實(shí)現(xiàn)對(duì)多種腸道菌的同時(shí)

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