血紅素加氧酶-1對(duì)大鼠肝纖維化及肝星狀細(xì)胞增殖、活化與凋亡的調(diào)控作用研究.pdf

1、肝纖維化是各種慢性肝病的共同病理學(xué)基礎(chǔ)，是形成肝硬化的必經(jīng)病理階段，也是臨床治療慢性肝病的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。其組織學(xué)特征表現(xiàn)為以膠原為主的細(xì)胞外基質(zhì)(extracellularmatrix，ECM)成分合成增多、降解相對(duì)不足而在肝內(nèi)過(guò)量沉積。肝星狀細(xì)胞(hepaticstellatecell，HSC)是產(chǎn)生ECM的主要來(lái)源，HSC的增殖活化是肝纖維化發(fā)生的中心事件。通過(guò)抑制HSC增殖、誘導(dǎo)HSC凋亡來(lái)阻斷甚至逆轉(zhuǎn)肝纖維化的發(fā)展，是抗肝纖維化治療

2、的重要策略。
　　 血紅素加氧酶-1(HemeOxygenase-1，HO-1)是人類和哺乳動(dòng)物組織中廣泛存在的一種加氧酶，是催化血紅素的起始酶和限速酶。HO-1及其催化產(chǎn)物一氧化碳(CarbonMonoxide，CO)、膽紅素及轉(zhuǎn)鐵蛋白在體內(nèi)有顯著的抗炎、抗氧化、調(diào)控細(xì)胞凋亡等重要作用。有研究顯示，HO-1在肝移植、急性肝損傷和缺血再灌注損傷等多種肝臟損害中，對(duì)肝細(xì)胞均具有保護(hù)作用。在慢性肝病進(jìn)展過(guò)程中誘導(dǎo)HO-1表達(dá)，可以減

3、少I型膠原的分泌，有效阻止肝纖維化的進(jìn)展。
　　 過(guò)氧化物酶體增生因子激活受體(peroxisomeproliferator-activatedreceptor,PPAR)是一種配體激活的轉(zhuǎn)錄因子，其亞型PPARγ主要分布于HSC。在肝纖維化進(jìn)展過(guò)程中，上調(diào)PPARγ表達(dá)可以抑制HSC激活、誘導(dǎo)HSC凋亡，進(jìn)而減輕肝纖維化的程度。核轉(zhuǎn)錄因子-κB(nuclearfactorkappa-light-chain-enhancerof

4、activatedBcells，NF-κB)是具有轉(zhuǎn)錄激活功能的蛋白質(zhì)，活化的NF-κB可促進(jìn)HSCs增殖及膠原的產(chǎn)生、誘導(dǎo)TNF-a、IL-6及TGF-β等相關(guān)細(xì)胞因子與纖維化因子的釋放、并減少HSCs凋亡，在促進(jìn)在肝纖維化進(jìn)程中同樣發(fā)揮重要作用。研究發(fā)現(xiàn)，PPARγ可以直接與NF-κB的亞基p50/p65結(jié)合，或通過(guò)競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合協(xié)同活化因子p300和CBP來(lái)抑制NF-κBDNA合成、轉(zhuǎn)錄與表達(dá)，誘導(dǎo)HSC的凋亡。對(duì)肝纖維化發(fā)生、發(fā)展起重

5、要的負(fù)調(diào)控作用。
　　 已有其他領(lǐng)域的研究顯示，HO-1同PPARγ之間存在相互調(diào)控，HO-1啟動(dòng)子區(qū)的基因多態(tài)性影響PPARγ的轉(zhuǎn)錄活性；HO-1的啟動(dòng)子區(qū)域還有NF-κB結(jié)合位點(diǎn)，誘導(dǎo)HO-1表達(dá)可以抑制NF-kB、TNF-α及IL-6等相關(guān)細(xì)胞因子的分泌。
　　 有關(guān)HO-1對(duì)肝臟保護(hù)機(jī)制的研究目前主要集中于HO-1的分解產(chǎn)物如膽綠素、一氧化碳(CO)和自由鐵的抗氧化及抗炎作用等方面，而HO-1對(duì)肝纖維化相關(guān)信號(hào)分

6、子調(diào)控方面的研究尚未見報(bào)道。為此，本課題從在體動(dòng)物實(shí)驗(yàn)和體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)兩方面入手，觀察HO-1的表達(dá)對(duì)大鼠肝纖維化及HSC-T6增殖、活化與凋亡的影響，同時(shí)研究HO-1表達(dá)對(duì)HSC-T6中PPARγ、NF-kB及其下游炎性信號(hào)分子與凋亡相關(guān)因子表達(dá)的影響，以進(jìn)一步探討HO-1調(diào)控HSC-T6增殖、活化及凋亡，進(jìn)而阻止肝纖維化進(jìn)展的信號(hào)分子機(jī)制。
　　 本課題包括以下三部分：
　　 第一部分:血紅素加氧酶-1對(duì)大鼠肝纖維化及

7、相關(guān)信號(hào)分子表達(dá)的影響。
　　 第二部分:血紅素加氧酶-1對(duì)大鼠肝星狀細(xì)胞增殖、活化及凋亡的影響。
　　 第三部分:血紅素加氧酶-1對(duì)大鼠肝星狀細(xì)胞調(diào)控作用的信號(hào)分子機(jī)制。
　　 第一部分:
　　 血紅素加氧酶-1對(duì)大鼠肝纖維化及相關(guān)信號(hào)分子表達(dá)的影響。
　　 目的：
　　 研究在構(gòu)建實(shí)驗(yàn)性肝纖維化大鼠模型的過(guò)程中抑制/誘導(dǎo)HO-1的表達(dá)對(duì)大鼠肝纖維化進(jìn)程及相關(guān)信號(hào)分子表達(dá)的影響。

8、　　 方法：
　　 采用復(fù)合因素構(gòu)建肝纖維化大鼠模型。實(shí)驗(yàn)分組：正常對(duì)照組,4周模型組，6周模型組，ZnPP-Ⅸ干預(yù)組，Hemin干預(yù)組。在造模第4～6周分別給予HO-1的誘導(dǎo)劑Hemin及抑制劑Znpp-Ⅸ隔日腹腔注射進(jìn)行干預(yù)。HE、Masson染色觀察肝臟病理組織學(xué)變化；免疫組織化學(xué)染色觀察肝組織中HO-1及α-SMA的分布與表達(dá)；全自動(dòng)生化分析儀檢測(cè)血清各項(xiàng)生化指標(biāo)；酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)檢測(cè)血清中透明質(zhì)酸(HA

9、)及Ⅲ型前膠原(PⅢP)水平；分光光度法檢測(cè)組織中羥脯氨酸(Hyp)含量；采用Real-timePCR技術(shù)檢測(cè)肝組織中α-SMA、HO-1、PPARy及NF-κB的mRNA表達(dá)；采用Westemblot技術(shù)檢測(cè)肝組織中HO-1、PPARy及NF-κBp65的蛋白表達(dá)。
　　 結(jié)果：
　　 1、HE及Masson染色結(jié)果表明肝纖維化模型構(gòu)建成功。Hemin干預(yù)組膠原纖維的增生、肝小葉的破壞及假小葉的形成程度明顯低于同期模型

10、組及Znpp-Ⅸ干預(yù)組（P＜0.05）：
　　 2、免疫組織化學(xué)染色及Real-timePCR、Westernblot檢測(cè)各實(shí)驗(yàn)組大鼠肝臟HO-l表達(dá)的結(jié)果顯示：隨著造模時(shí)間延長(zhǎng)，纖維化肝組織中HO-1表達(dá)范圍擴(kuò)大且強(qiáng)度增加(P＜0.01);Hemin干預(yù)組HO-1表達(dá)范圍及強(qiáng)度較對(duì)照組及模型組增加更加明顯（P＜0.01），而Znpp-Ⅸ干預(yù)組HO-1表達(dá)強(qiáng)度則減弱（P＜0.01）：
　　 3、免疫組織化學(xué)染色及Real

11、-timePCR檢測(cè)大鼠肝臟α-SMA表達(dá)的結(jié)果顯示：肝纖維化進(jìn)展過(guò)程中肝組織中α-SMA表達(dá)逐漸增加，Hemin的干預(yù)使α-SMA的表達(dá)明顯下降（P＜0.01），Znpp-Ⅸ干預(yù)組α-SMA的表達(dá)則增加（P＜0.05）；
　　 4、各實(shí)驗(yàn)組大鼠肝臟生化指標(biāo)的變化：大鼠肝功能的損害程度隨肝纖維化的進(jìn)展而逐漸加重（P＜0.05）；Hemin干預(yù)組ALT、AST、ALB及TBIL各項(xiàng)生化指標(biāo)較同期模型組及Znpp-Ⅸ干預(yù)組則明顯恢復(fù)

12、（P＜0.05）；
　　 5、各實(shí)驗(yàn)組大鼠肝臟膠原代謝的變化：大鼠血清HA、PⅢP及肝組織中Hyp含量隨著肝纖維化程度的加重而逐漸增加（P＜0.05），Hemin的干預(yù)使HA、PⅢP及Hyp含量較同期模型組及Znpp-Ⅸ干預(yù)組明顯下降（P＜0.05）：
　　 6、Real-timePCR及Westemblot檢測(cè)各實(shí)驗(yàn)組大鼠肝組織中PPARγmRNA及蛋白表達(dá)顯示：隨著肝纖維化程度的加重，肝組織內(nèi)PPARγ的mRNA表達(dá)

13、逐漸下降（P＜0.01），使用Znpp-Ⅸ的干預(yù)組同6周模型組相比雖無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，但仍有下降趨勢(shì)（P=0.195）；而Hemin干預(yù)組PPARγ的mRNA表達(dá)則較6周模型組明顯增加（P＜0.05）。PPARγ蛋白表達(dá)與mRNA變化趨勢(shì)一致；
　　 7、Real-timePCR及Westernblot檢測(cè)各實(shí)驗(yàn)組大鼠肝組織中NF-κBmRNA及蛋白表達(dá)顯示：隨著肝纖維化程度的加重，肝組織中NF-κB的mRNA表達(dá)逐漸增加（P＜0.

14、01）；Znpp-Ⅸ干預(yù)組較6周模型組增加更為明顯（P＜0.05），而Hemin干預(yù)組中的NF-κBmRNA表達(dá)則顯著下降(P＜0.05)。NF-κB蛋白表達(dá)與mRNA變化趨勢(shì)一致。
　　 結(jié)論：
　　 HO-1的誘導(dǎo)表達(dá)可以明顯減輕肝纖維化大鼠肝臟的炎癥反應(yīng)程度、降低肝組織α-SMA及膠原纖維的表達(dá)，減輕肝纖維化：而HO-1阻止肝纖維化進(jìn)展的肝臟保護(hù)作用可能是通過(guò)對(duì)肝組織中PPARγ及NF-κB表達(dá)的調(diào)控實(shí)現(xiàn)的。

15、>　　 第二部分：
　　 血紅素加氧酶-1對(duì)大鼠肝星狀細(xì)胞增殖、活化及凋亡的影響
　　 目的：
　　 研究抑制/誘導(dǎo)HO-1的表達(dá)對(duì)HSC-T6增殖、活化及凋亡的影響。
　　 方法：
　　 以活化的HSC-T6為研究對(duì)象。不同濃度的Hemin(10μmol/1,20μmol/1、40μmol/1)及Znpp-Ⅸ(5μmol/1、10μmol/1、20μmol/1)作用于HSC-T6不同的時(shí)間(1

16、2h，24h,48h)，通過(guò)MTTLk色法檢測(cè)HSC-T6的增殖情況、臺(tái)盼藍(lán)拒染實(shí)驗(yàn)觀察細(xì)胞存活率及乳酸脫氫酶(LDH)釋放實(shí)驗(yàn)觀察藥物對(duì)細(xì)胞的毒性作用，以此篩選出Hemin或Znpp-Ⅸ發(fā)揮誘導(dǎo)/抑制HO-1表達(dá)效應(yīng)的最適濃度及作用時(shí)間用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)分組：空白對(duì)照組、Hemin干預(yù)組、Znpp-Ⅸ干預(yù)組及Hemin+Znpp干預(yù)組。采用MTT法檢測(cè)各實(shí)驗(yàn)組HSC-T6的增殖情況；ELISA方法檢測(cè)HSC-T6上清液中HA及PⅢP含

17、量；免疫細(xì)胞化學(xué)技術(shù)檢測(cè)HSC-T6中HO-1及α-SMA的分布與表達(dá)；Real-timePCR檢測(cè)HSC-T6中HO-1及α-SMA的mRNA表達(dá)；Westernblot檢測(cè)HSC-T6中HO-1及α-SMA蛋白表達(dá)；TUNEL法及AnnexinV-FITC/PI聯(lián)合標(biāo)記流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)HSC-T6的凋亡：Real-timePCR檢測(cè)HSC-T6中抗凋亡蛋白Bcl-2及Caspase-3的mRNA表達(dá)。
　　 結(jié)果：
　　

18、 1、HO-1的誘導(dǎo)劑Hemin對(duì)HSC-T6增殖發(fā)揮抑制作用且無(wú)明顯細(xì)胞毒性的最適濃度為20μmol/1（13μg/ml）。抑制劑ZnPP-Ⅸ對(duì)HSC-T6增殖發(fā)揮促進(jìn)作用且無(wú)明顯細(xì)胞毒性的最適濃度為10μmol/l（3μg/ml），作用時(shí)間選擇24h;
　　 2、免疫細(xì)胞化學(xué)技術(shù)、Real-timePCR及Westernblot對(duì)各組HSC-T6中HO-1表達(dá)的檢測(cè)顯示：Hemin干預(yù)組的HO-1表達(dá)范圍及強(qiáng)度較正常對(duì)照及

19、其他干預(yù)組均顯著升高(P＜0.01);Znpp-Ⅸ干預(yù)組同對(duì)照組相比雖無(wú)顯著差異，但也呈下降趨勢(shì)；Hemin+Znpp-Ⅸ共同干預(yù)組中HO-1的表達(dá)范圍及強(qiáng)度較單純Hemin干預(yù)組顯著下降（P＜0.05）；
　　 3、免疫細(xì)胞化學(xué)技術(shù)、Real-timePCR及Westernblot對(duì)各組HSC-T6中α-SMA表達(dá)的檢測(cè)顯示：Hemin干預(yù)組可見α-SMA表達(dá)范圍及強(qiáng)度較對(duì)照組顯著下降（P＜0.01），Znpp-Ⅸ干預(yù)組則升高

20、（P＜0.01）；Hemin+Znpp-Ⅸ共同干預(yù)組α-SMA表達(dá)范圍及強(qiáng)度較單純Hemin干預(yù)組增加（P＜0.01）；
　　 4、各實(shí)驗(yàn)組HSC-T6增殖情況：Hemin干預(yù)組HSC-T6的增殖活性（MTT值0.867±0.023）較對(duì)照組下降16.15～（P＜0.01）；Znpp-Ⅸ組（MTT值為1.161±0.015）較對(duì)照組升高12.28％(P＜0.01)；Hemin+Znpp-Ⅸ組則比Hemin單獨(dú)處理組HSC-T6增

21、殖活性升高（P＜0.05）；
　　 5、各實(shí)驗(yàn)組HSC-T6膠原代謝的變化：Hemin干預(yù)組細(xì)胞上清液中HA及PⅢP含量較對(duì)照組顯著下降（P＜0.01），Znpp-Ⅸ干預(yù)組二者均顯著升高（P＜0.01），而Hemin+Znpp-Ⅸ干預(yù)組細(xì)胞上清液中HA及PⅢP含量較單純Hemin干預(yù)組升高（P＜0.01）：
　　 6、TUNEL及AnnexinV-FITC/Pl流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)各組HSC-T6的凋亡：TUNEL結(jié)果顯示：H

22、emin干預(yù)組HSC-T6凋亡指數(shù)(23.5％±2.02％)較對(duì)照組（3.25％±0.63％）增加了6.23倍（P＜0.01）；Znpp-Ⅸ干預(yù)組（4.00％±0.82％）同對(duì)照組相比無(wú)顯著差異（P=0.574）；而Hemin+Znpp-Ⅸ組凋亡指數(shù)(16.25％±1.38％)則較單純Hemin干預(yù)組下降（P＜0.01）。流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)結(jié)果同上述趨勢(shì)一致；
　　 7、Real-timePCR檢測(cè)凋亡相關(guān)蛋白Bcl-2及Caspa

23、se-3的mRNA表達(dá)顯示：同對(duì)照組相比較Hemin干預(yù)組Bcl-2mRNA表達(dá)顯著下降（P＜0.05），Caspase-3mRNA表達(dá)升高（P＜0.01）；Znpp-Ⅸ干預(yù)組Bcl-2mRNA升高（P＜0.05），而Caspase-3mRNA表達(dá)下降；Hemin及Znpp-Ⅸ共同干預(yù)組中Bcl-2mRNA表達(dá)量較單純Hemin干預(yù)組又有所回升(P＜0.05)，而Caspase-3mRNA的表達(dá)則有所下降（P＜0.05）。
　　

24、 結(jié)論：
　　 HO-1的誘導(dǎo)表達(dá)能夠抑制HSC-T6的增殖活性及膠原蛋白的代謝能力；HO-1還能夠通過(guò)影響凋亡相關(guān)蛋白如Bcl-2及Caspase-3的表達(dá)來(lái)調(diào)控HSC-T6的凋亡。
　　 第三部分：
　　 血紅素加氧酶-1對(duì)大鼠肝星狀細(xì)胞調(diào)控作用的信號(hào)分子機(jī)制
　　 目的：
　　 研究抑制/誘導(dǎo)HO-1表達(dá)對(duì)HSC-T6內(nèi)PPARγ、NF-κB及下游炎性細(xì)胞因子表達(dá)的調(diào)控作用。
　　

25、方法：
　　 實(shí)驗(yàn)分組為空白對(duì)照組、Hemin干預(yù)組、Hemin+GW9662組、Znpp-Ⅸ干預(yù)組、Znpp-Ⅸ+羅格列酮組。采用免疫細(xì)胞化學(xué)技術(shù)檢測(cè)PPARγ在HSC-T6中的表達(dá)；免疫熒光技術(shù)檢測(cè)NF-κBp65在HSC-T6中的表達(dá)；Realtime-PCR技術(shù)檢測(cè)HSC-T6中HO-1、PPARγ及NF-κB的mRNA表達(dá)：Westemblot檢測(cè)HSC-T6中HO-1、PPARy及NF-κBp65的蛋白表達(dá)；采用EL

26、ISA方法檢測(cè)各實(shí)驗(yàn)組HSC-T6培養(yǎng)上清液中TGF-β1及IL-6的含量。
　　 結(jié)果：
　　 1、Real-timePCR及Westemblot檢測(cè)各組HSC-T6中HO-1的mRNA及蛋白表達(dá)：Hemin干預(yù)組HO-1表達(dá)較對(duì)照組明顯增加（P＜0.01）；Hemin+GW9662組HO-1的mRNA表達(dá)較單純Hemin干預(yù)組下降19.96％（P＜0.05），蛋白表達(dá)下降16.05％（P＜0.05）；Znpp-Ⅸ干預(yù)

27、組HO-1表達(dá)較對(duì)照組明顯下降（P＜0.01）；而Znpp-Ⅸ+羅格列酮組，HO-1的mRNA表達(dá)較單純Znpp-Ⅸ干預(yù)組升高18.32％（P＜0.05），蛋白表達(dá)升高13.7％（P＜0.05）：
　　 2、Real-timePCR及Westernblot檢測(cè)各組HSC-T6中PPARγ、NF-κBp65的mRNA及蛋白表達(dá)：Westernblot結(jié)果顯示：Hemin干預(yù)組PPARγ表達(dá)較對(duì)照組升高（P＜0.01），NF-κBp

28、65表達(dá)則下降（P＜0.01）；Znpp-Ⅸ干預(yù)組PPARγ表達(dá)較對(duì)照組下降（P＜0.01），而NF-κBp65表達(dá)升高(P＜0.01)。Hemin+GW9662同單純Hemin組比較PPARγ表達(dá)下降17.78％、NF-κB的表達(dá)則升高28.94％（p＜0.05）：Znpp-Ⅸ+羅格列酮組同單純Znpp-Ⅸ組比較PPARγ表達(dá)升高18.6％、NF-κB蛋白表達(dá)則下降23.16％(p＜0.01)。Real-timePCR的mRNA檢測(cè)同

29、上述趨勢(shì)基本一致；
　　 3、免疫細(xì)胞化學(xué)及免疫熒光檢測(cè)HSC-T6中PPARγ.NF-κBp65的表達(dá)：PPARγ及NF-κBp65主要定位于HSC-T6細(xì)胞核。對(duì)照組細(xì)胞核PPARγ表達(dá)微弱；Hemin干預(yù)后細(xì)胞核PPARγ表達(dá)明顯增強(qiáng)，而應(yīng)用GW9662預(yù)孵育的實(shí)驗(yàn)組PPARγ表達(dá)則較單純Hemin干預(yù)組減弱；Znpp-Ⅸ干預(yù)組HSC-T6細(xì)胞核中PPARγ表達(dá)較對(duì)照組下降，使用誘導(dǎo)劑羅格列酮預(yù)孵育的實(shí)驗(yàn)組則可看到PPAR

30、γ表達(dá)較單純Znpp-Ⅸ干預(yù)組略有增加。而NF-κBp65的免疫熒光檢測(cè)結(jié)果則同PPARγ變化趨勢(shì)相反；
　　 4、各實(shí)驗(yàn)組HSC-T6培養(yǎng)上清液中TGF-β1及IL-6的含量：ELISA檢測(cè)結(jié)果顯示，TGF-β1及IL-6在各組的變化趨勢(shì)一致。Hemin干預(yù)組細(xì)胞上清液中TGF-β1及IL-6的釋放量較對(duì)照組明顯下降(P＜0.01)，Hemin+GW9662組則觀察到二者較單純Hemin組均有所增加（P＜0.05）；Znpp-