舒肝顆粒對大鼠肝星狀細胞凋亡的影響.pdf

1、目的：肝纖維化(HF)是各種原因引起的慢性肝損傷所共有的病理改變，肝星狀細胞(HSC)的活化增殖是HF形成的中心環(huán)節(jié)，細胞外基質(ECM)過量產(chǎn)生和沉積是形成HF，最終導致肝硬化、肝功能衰竭的主要原因。因此，抑制HSC活化增殖、促進HSC凋亡、抑制膠原合成分泌、促進膠原降解可抗肝纖維化。目前，抗肝纖維化尚無有效的治療藥物，西醫(yī)抗肝纖維化治療主要有抗氧化劑、細胞因子調節(jié)劑、血管活性物質調節(jié)劑、抑制信號通路等藥物，這些藥物或因毒性太大，或抗

2、肝纖維化的作用不強，使臨床應用受到限制。近年來，中醫(yī)中藥治療肝纖維化顯示出特有的優(yōu)越性，包括單方和復方的應用和研究，有的研究已深入到分子水平。剔毒護肝方、復方861均從分子水平研究表明具有抑制體外培養(yǎng)的HSC增殖和促進HSC凋亡的作用[1,2]。舒肝顆粒主要是針對酒精性肝病(ALD)尤其是酒精性肝纖維化的防治。通過細胞實驗已證明舒肝顆粒能抑制肝星狀細胞的增殖，抑制膠原蛋白的分泌，可減少膠原纖維在肝臟內的沉積。 為了進一步探討舒肝

3、顆粒對肝纖維化的逆轉是否有作用，采用舒肝顆粒作用于體外培養(yǎng)大鼠肝星狀細胞，觀察其是否對大鼠肝星狀細胞凋亡有影響，以探討舒肝顆粒對肝纖維化的防治作用的機制，為舒肝顆粒的臨床應用進一步提供理論依據(jù)。 方法： 1．體外培養(yǎng)大鼠肝星狀細胞株(HSC-T6)。以5×104接種培養(yǎng)好的肝星狀細胞在六孔板，培養(yǎng)24小時后，加入舒肝顆粒，分為三個濃度組：4.2mg/ml，2.8mg/ml，1.4mg/ml。加藥作用24小時后，取出鏡下觀

4、察細胞形態(tài)的變化。然后吹打細胞，使其成為單細胞懸液，收集細胞懸液，1500轉/分離心，冷PBS沖洗后再離心，丟棄上清液，每根試管中加入100μl冷PBS,振蕩搖勻，成單細胞懸液；調整細胞濃度1×106，緩沖液稀釋1:4；取100μl懸液，于5ml流式管中加入5μl AnnexinV/FITC和10μl 20mg/ml的碘化丙錠，混勻后室溫避光孵育15min；在反應管中加入400μl PB，流式細胞儀分析結果。 2．以5×104接

5、種肝星狀細胞在六孔板，培養(yǎng)24小時后加藥，濃度組同前，加藥培養(yǎng)24小時后，鏡下觀察。吹打細胞，使其成為單細胞懸液，收集細胞液，1500轉/分離心，冷PBS沖洗后再離心，丟棄上清液，每根試管中加入100μl冷PBS，振蕩搖勻，成單細胞懸液；調整細胞濃度1×106，緩沖液稀釋1:4；取100μl懸液，于5ml流式管中加入5μl CD95抗體，混勻后室溫避光孵育15min；在反應管中加入400μlPBS，流式細胞儀分析結果。通過流式細胞儀檢測

6、CD95，探討舒肝顆粒誘導肝星狀細胞凋亡的可能途徑。 3．細胞培養(yǎng)后爬片，以同樣的藥物濃度作用24小時后，用4℃預冷1:1丙酮和乙醇固定；蒸餾水沖洗、PBS浸泡、雙氧水消除內源性過氧化物酶的活性；采用SABC法，先滴加試劑A孵育15分鐘，再滴加一抗Bax，37℃孵育3小時，PBS沖洗；依次滴加試劑B、試劑C，每次孵育10分鐘，PBS沖洗三次；再滴加DAB顯色劑，沖洗、晾干、封片；采用Image plus 7.0系統(tǒng)顯微鏡照相。4

7、．重復上述實驗過程檢測Bcl-2。 結果： 1．正常對照組的凋亡率是3.4±0.82，不同濃度的舒肝顆粒1.4mg/ml，2.8mg/ml，4.2mg/ml，對肝星狀細胞的凋亡率分別是：42.61±6.42,61.07±3.19,87.84±5.49，各組的凋亡率較正常對照組明顯增高，差別具有顯著性(P<0.05)。在1.4mg/ml組，肝星狀細胞的早期凋亡率明顯較正常對照組增加(P<0.05)，而中晚期凋亡率較少。在2

8、.8mg/ml組，肝星狀細胞的早期凋亡率和中晚期凋亡率均明顯升高。4.2mg/ml組，肝星狀細胞在舒肝顆粒作用24小時后，大部分已屬于中晚期凋亡，早期凋亡較低濃度組明顯減少，但較正常對照組仍明顯增高(P<0.05)，從早期凋亡和中晚期凋亡的總體趨勢看，隨著濃度增高，總的凋亡率增加。 2.正常對照組的CD95的表達率是0.10±0.03,不同濃度的舒肝顆粒1.4mg/ml，2.8mg/ml，4.2mg/ml，對肝星狀細胞的CD95

9、的表達率分別是：4.77±0.84，9.44±0.61，24.51±5.91(P<0.05)，并隨著濃度增高，CD95的表達率也增高。 3．Bax的表達正常組最少，隨著藥物濃度組的增高，Bax的表達增高，且差別有顯著性(P<0.05)，Bcl-2的表達，藥物濃度組與正常對照組無明顯差別(P>0.05)。Bax/bcl-2的比值隨著藥物濃度組的增加而比值升高。 結論： 1．舒肝顆粒可誘導肝星狀細胞的凋亡，且呈濃度依