白楊素對人肝星狀細(xì)胞LX-2及肝纖維化小鼠作用的研究.pdf

1、目的：肝纖維化作為慢性肝臟疾病的結(jié)局，其中心環(huán)節(jié)是肝細(xì)胞損傷引起的肝星狀細(xì)胞(Hepatic Stellate Cells, HSCs)的激活。HSCs的激活可破壞肝臟細(xì)胞外基質(zhì)(ExtracellularMembrane, ECM)生成和降解之間的平衡，使 ECM蛋白過多沉積于肝臟，從而引起肝纖維化，甚至肝硬化。天然植物藥白楊素(Chrysin, CH)具有抗氧化、抗炎、抗病毒、抗腫瘤等作用，但其對 HSCs和肝纖維化的影響目前尚不清

2、楚。因此，本研究旨在探討 CH對活化的人肝星狀細(xì)胞珠 LX-2的影響及其在四氯化碳(Carbon Tetrachloride，CCl4)導(dǎo)致的肝纖維化小鼠的肝損傷修復(fù)中的作用。
　　方法：實(shí)驗(yàn)包括體外和體內(nèi)兩部分。體外實(shí)驗(yàn)：⑴ CCK8實(shí)驗(yàn)確定CH的最佳作用時(shí)間和最佳作用濃度：①CH作用濃度：0、5μg/ml、10μg/ml、15μg/ml、20μg/ml及25μg/ml。②CH作用時(shí)間：24h、48h、72h、96h。③實(shí)驗(yàn)分組

3、：助溶劑作用的對照組、CH作用組(濃度由CCK8實(shí)驗(yàn)確定)。⑵倒置顯微鏡觀察兩組 LX-2細(xì)胞形態(tài)改變。⑶ qRT-PCR實(shí)驗(yàn)檢測反應(yīng)HSCs活化狀態(tài)的標(biāo)記物(αSMA)、ECM產(chǎn)物(COL1、COL2、FN)及JAK/STAT信號通路抑制因子(SOCS1、 SOCS3)在兩組間的表達(dá)水平。⑷Western blot實(shí)驗(yàn)檢測αSMA、ECM產(chǎn)物(COL1、COL2、FN、Agg)、Smad信號途徑激活因子(TGFβ1、TGFβ2)和 J

4、AK/STAT信號通路抑制因子(SOCS1、SOCS3)在兩組間的表達(dá)水平。體內(nèi)實(shí)驗(yàn)：⑴昆明小鼠 CCl4肝纖維化模型的建立：①實(shí)驗(yàn)分組：玉米油對照組、CCl4造模組。②給藥途徑及時(shí)間：腹腔注射；2次/周，共11次。③給藥：對照組給予5ml/kg玉米油；造模組給予1ml/kg CCl4+4ml/kg玉米油混合物。⑵ CH干預(yù)：①實(shí)驗(yàn)分組：陰性對照組(助溶劑干預(yù)的玉米油對照組)、CCl4進(jìn)一步分三組，分別為助溶劑干預(yù)組、25mg/kg及5

5、0mg/kg CH治療組。②給藥途徑及時(shí)間：灌胃，1次/d，共計(jì)15次。③評估各組炎癥、壞死程度和纖維化程度：CH干預(yù)結(jié)束，取小鼠肝臟，固定、包埋、切片、HE染色，顯微鏡下觀察，評估其炎癥、壞死和纖維化程度。
　　結(jié)果：⑴ CH對 LX-2細(xì)胞的半數(shù)抑制濃度 IC50分別為：48h：25.60μg/ml(95％CI:21.35-30.64μg/ml)；72h：22.25μg/ml(95%CI:20.37-24.31μg/ml)；9

6、6h：18.96μg/ml(95%CI:17.91-20.07μg/ml)。⑵與對照組相比，經(jīng)25μg/ml CH作用48h后，LX-2細(xì)胞增殖活性降低，細(xì)胞由肥胖的肌成纖維細(xì)胞樣變?yōu)槔w細(xì)的纖維細(xì)胞樣，由活化細(xì)胞形態(tài)進(jìn)入靜止期細(xì)胞形態(tài)。⑶在 mRNA水平上，與對照組相比，CH作用組αSMA及 COL1表達(dá)水平降低，COL2表達(dá)水平升高，且差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p<0.05)，F(xiàn)N表達(dá)水平升高，但差異不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p>0.05)；SOC

7、S1表達(dá)水平明顯升高，且差異具有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p<0.01)，SOCS3表達(dá)水平升高，但差異不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p>0.05)。⑷在蛋白水平上，與對照組相比，CH作用組αSMA、COL1、COL2、FN、Agg、TGFβ1及TGFβ2蛋白表達(dá)水平降低，而SOCS1及SOCS3蛋白表達(dá)水平升高。⑸昆明小鼠經(jīng)1mg/kg CCl4造模，2次/周，連續(xù)5周半，纖維化造模可以成功。⑹不同方式處理后，4組肝臟標(biāo)本在炎癥、壞死程度(G)和纖維化程度