低氧誘發(fā)自噬對(duì)喉癌Hep-2細(xì)胞放化療敏感性的影響及Stat3對(duì)自噬調(diào)控作用.pdf

1、目的:觀察低氧微環(huán)境對(duì)喉癌Hep-2細(xì)胞增殖情況的影響及其對(duì)細(xì)胞自噬的作用，進(jìn)一步研究細(xì)胞自噬對(duì)喉癌Hep-2細(xì)胞放化療敏感性的影響，探究Stat3信號(hào)通路對(duì)細(xì)胞自噬的調(diào)控作用及可能機(jī)制，尋求腫瘤預(yù)防和治療的新策略。
　　方法:
　　1體外常氧和低氧條件下培養(yǎng)喉癌Hep-2細(xì)胞，給予不同濃度順鉑(0μmol/L,10μmol/L,20μmol/L,40μmol/L,80μmol/L,160μmol/L),不同劑量放射線(0

2、Gy,5Gy,10Gy,15Gy,20Gy)后繼續(xù)培養(yǎng)24h，MTT方法檢測(cè)細(xì)胞增殖情況。
　　2體外不同時(shí)間(3h，6h，9h，12h，24h)低氧培養(yǎng)喉癌Hep-2細(xì)胞，Western blot法檢測(cè)蛋白Stat3，p-Stat3，HIF-1α及自噬相關(guān)蛋白Beclin1和LC3的表達(dá)情況。給予Jak激酶抑制劑AG490(40mg/L)預(yù)處理1h繼續(xù)低氧培養(yǎng)6h，12h，24h后，Western blot法檢測(cè)蛋白Stat3，

3、p-Stat3及自噬相關(guān)蛋白Beclin1和LC3的表達(dá)情況。
　　3體外經(jīng)AG49040mg/L預(yù)處理1h，3-MA(4mmol/L)預(yù)處理3h聯(lián)合不同濃度順鉑（0μmol/L，10μmol/L，20μmol/L，40μmol/L，80μmol/L），不同劑量放射線(0Gy，5 Gy,10 Gy,15Gy)繼續(xù)低氧培養(yǎng)24h，MTT方法檢測(cè)細(xì)胞增殖情況。雷帕霉素(100nmol/L)預(yù)處理3h聯(lián)合不同濃度順鉑化療（0μmol/L

4、，10μmol/L，20μmol/L，40μmol/L，80μmol/L），不同劑量放射線放療(0 Gy,5 Gy,10 Gy,15Gy)后繼續(xù)常氧培養(yǎng)24h，MTT方法檢測(cè)胞增殖情況。Western blot的方法檢測(cè)分別經(jīng)3-MA和雷帕霉素處理后自噬標(biāo)志性蛋白LC3的表達(dá)情況。
　　結(jié)果:
　　1不同濃度的順鉑、不同劑量的放射線干預(yù)喉癌Hep-2細(xì)胞后對(duì)細(xì)胞增殖具有抑制作用且具有濃度依賴性和劑量依賴性，不同濃度順鉑化療組

5、:低氧F=192.110，P=0.000＜0.01，常氧F=123.146，P=0.000＜0.01;不同劑量放射線放療組:低氧F=103.438，P=0.000＜0.05，常氧F=264.641，P=0.000＜0.01;差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（方差分析的統(tǒng)計(jì)學(xué)方法）。常氧組與低氧組相比，不同濃度順鉑化療和不同劑量放射線放療，低氧組細(xì)胞的增殖抑制作用明顯下降，P＜0.01（獨(dú)立樣本T檢驗(yàn)的統(tǒng)計(jì)學(xué)方法），差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　2不

6、同處理方式后蛋白Stat3，p-Stat3，HIF-1α及自噬相關(guān)蛋白Beclin1和LC3的表達(dá)變化情況。
　　2.1不同低氧時(shí)間(0h，3h，6h，9h，12h，24h)培養(yǎng)Hep-2細(xì)胞Western blot法檢測(cè)蛋白Stat3，p-Stat3，HIF-1α及自噬相關(guān)蛋白Beclin1和LC3的表達(dá)情況，方差分析的統(tǒng)計(jì)學(xué)方法進(jìn)行分析。與常氧條件下相比較Stat3蛋白在低氧條件下無(wú)明顯變化，P＞0.05，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;蛋

7、白p-Stat3及自噬相關(guān)蛋白Beclin1和LC3蛋白的變化于低氧6h后逐漸升高，24h達(dá)到較高水平，低氧培養(yǎng)6h，9h，12h，24h與常氧比較蛋白表達(dá)明顯升高，P＜0.05，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;HIF-1α蛋白的表達(dá)情況于低氧9h開(kāi)始逐漸升高，24h達(dá)到高峰，P＜0.05，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　2.2體外低氧培養(yǎng)Hep-2細(xì)胞，給予AG490預(yù)處理1h后繼續(xù)低氧培養(yǎng)6h,12h，24h，不同時(shí)間點(diǎn)AG490組與未加AG4

8、90組比較，Stat3蛋白表達(dá)無(wú)明顯變化，P＞0.05，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;蛋白p-Stat3，Beclin1和LC3表達(dá)明顯下降，6h，12h，24h，P＜0.01，差異具有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（獨(dú)立樣本T檢驗(yàn)的統(tǒng)計(jì)學(xué)分析方法）。
　　2.33-MA(4mmol/L)、雷帕霉素（100nmol/L）預(yù)處理3h繼續(xù)分別低氧和常氧條件下培養(yǎng)24h，常氧組(24N)和常氧加雷帕霉素組（24N+RAPA）比較，24N+RAPA組LC3蛋白表達(dá)情

9、況明顯高于24N組，t=11.162，P=0.000＜0.01，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;低氧組(24H)與低氧加3-MA組(24H+3-MA)比較，24H+3-MA組LC3蛋白表達(dá)情況明顯低于24H組，t=13.074，P=0.000＜0.01，差異同樣具有顯著差統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（獨(dú)立樣本T檢驗(yàn)的統(tǒng)計(jì)學(xué)方法）。
　　3 MTT檢測(cè)不同濃度順鉑、不同劑量放射線與AG490，3-MA及雷帕霉素聯(lián)合應(yīng)用后對(duì)細(xì)胞增殖的影響，獨(dú)立樣本T檢驗(yàn)的統(tǒng)計(jì)學(xué)方

10、法進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。
　　3.1體外經(jīng)AG49040mg/L預(yù)處理1h，3-MA(4mmol/L)預(yù)處理3h后聯(lián)合不同濃度順鉑化療、不同劑量放射線放療繼續(xù)低氧條件下培養(yǎng)24h后，MTT檢測(cè)細(xì)胞增殖情況，AG490，3-MA組與僅放化療組相比，細(xì)胞增殖抑制明顯增加，當(dāng)順鉑濃度為10μmol/L，3-MA組與單純化療組相比P＜0.05，其他AG490，3-MA組與僅放化療組相比P＜0.01，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　3.2體外雷帕霉

11、素(100nmol/L)預(yù)處理3h后聯(lián)合不同濃度順鉑化療，不同放射劑量放療后繼續(xù)常氧培養(yǎng)24h后，雷帕霉素組細(xì)胞增殖抑制較僅放化組明顯提高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(聯(lián)合應(yīng)用雷帕霉素組與單純放射線放療相比，僅10Gy,15Gy時(shí)P＜0.05，其他各組P＜0.01)。
　　結(jié)論:
　　1不同濃度順鉑化療和不同劑量放射線放療在低氧和常氧條件下均對(duì)Hep-2細(xì)胞增殖具有抑制作用，且低氧可以增加腫瘤細(xì)胞對(duì)放化療的抵抗。
　　2低氧可以

12、促進(jìn)Hep-2細(xì)胞Stat3的磷酸化，誘導(dǎo)HIF-1α的表達(dá)，而對(duì)總Stat3沒(méi)有影響;低氧可以促進(jìn)自噬相關(guān)蛋白Beclin1和LC3的表達(dá)，誘發(fā)細(xì)胞自噬。抑制Stat3的磷酸化可以抑制自噬相關(guān)蛋白Beclin1和LC3的表達(dá)，從而抑制自噬過(guò)程，增加腫瘤細(xì)胞低氧放化療敏感性。
　　33-MA可以抑制喉癌Hep-2細(xì)胞低氧誘發(fā)的自噬，減少自噬相關(guān)蛋白LC3的表達(dá)，增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞低氧放化療敏感性;雷帕霉素可以誘發(fā)Hep-2細(xì)胞自噬，增加