低氧條件下Stat3反義寡核苷酸對喉癌細胞系Hep-2化療增敏的分子機制.pdf

1、目的：信號轉(zhuǎn)導子和轉(zhuǎn)錄激活子3(Stat3)信號通路在人類多種腫瘤中持續(xù)激活，影響腫瘤細胞增殖、凋亡、浸潤及轉(zhuǎn)移。本試驗通過Stat3反義寡核苷酸轉(zhuǎn)染喉鱗癌細胞系Hep-2，在模擬人體實體腫瘤低氧環(huán)境下檢測順鉑作用后細胞凋亡、周期及P-Stat3、HIF-1a(HIF-1)、VEGF等相關(guān)蛋白表達。探討低氧對Stat3及相關(guān)因子信號傳導的作用，以及低氧條件下Stat3反義寡核苷酸對化療的影響及作用機制。為研發(fā)高效低毒的抗癌藥物及化療輔助

2、藥物提出理論及方法學依據(jù)。 方法： 1.細胞培養(yǎng)環(huán)境處理：低氧培養(yǎng)實驗條件為37℃、5％CO2、2％O2、93％N2、飽和濕度，對照常氧培養(yǎng)環(huán)境為37℃、5％CO2、20％O2、75％N2、飽和濕度。流式細胞技術(shù)檢測喉鱗癌細胞系Hep-2低氧3h、6h、12h、24h以及常氧對照組p-Stat3、HIF-1a、VEGF的表達。 2.流式細胞檢測細胞常氧和低氧條件下應(yīng)用濃度為0μg/ml、1μg/ml、3μg/ml

3、、5μg/ml順鉑對Hep-2細胞作用6h后凋亡率。 3.應(yīng)用MTT法檢測不同濃度(100、200、400nmol/L)Stat3AS-ON、Stat3 S-ON轉(zhuǎn)染組，脂質(zhì)體組及未轉(zhuǎn)染組Hep-2細胞作用24h后的細胞存活率。 4 流式細胞技術(shù)檢測Stat3 AS-ON(200nmol/L)轉(zhuǎn)染Hep-2細胞24h后低氧條件下順鉑(3μg/ml)作用6小時后細胞周期、細胞凋亡以及p-Stat3、HIF-1a、VEGF蛋白表達。

4、 結(jié)果： 1.低氧條件下p-Stat3、HIF-1a、VEGF蛋白表達增強，對照組FI為1，3h、6h、12h和24h p-Stat3 FI值分別為1.04±0.03、1.12±0.03、1.16±0.05、1.12±0.05。HIF-1a對應(yīng)FI值為0.91±0.32、1.87±0.83、3.91±0.67、5.04±0.51。VEGF對應(yīng)FI值為1.06±0.14、1.08±0.14、1.71±0.26、2.20±0

5、.75。p-Stat3與已證實的與低氧密切相關(guān)的HIF-1a存在正相關(guān)關(guān)系(r=0.589)，且p-Stat3的表達先于HIF-1a。表明p-Stat3對HIF-1a的表達具有調(diào)節(jié)作用。 2.應(yīng)用流式細胞技術(shù)檢測Hep-2細胞凋亡率在順鉑濃度為0～5μg/ml范圍內(nèi)隨濃度上升而增加，1μg/ml順鉑作用低氧與常氧組細胞凋亡率無差異，而3μg/ml、5μg/ml順鉑同等濃度下低氧組腫瘤細胞凋亡率低于常氧組。表明低氧可以導致化療抵抗

6、和化療敏感性降低。 3.熒光顯微鏡下各濃度Stat3寡核苷酸轉(zhuǎn)染組均可見綠色熒光。脂質(zhì)體介導寡核苷酸轉(zhuǎn)染復合物轉(zhuǎn)染30min進入細胞質(zhì)，1h后80％～90％細胞可見細胞核內(nèi)熒光，同時細胞漿中也有較強的熒光分布，2h后達90％以上。轉(zhuǎn)染24h后MTT檢測細胞存活率隨Stat3 AS-ON濃度(0-400nmol/L)增加下降，與脂質(zhì)體對照組比較有統(tǒng)計學差異，轉(zhuǎn)染100nmol/L、200nmol/L Stat3 S-ON后細胞存活

7、率與脂質(zhì)體對照組無統(tǒng)計學差異，而400nmol/L Stat3 S-ON對細胞亦有抑制作用與脂質(zhì)體對照組比較有統(tǒng)計學差異。 4.應(yīng)用Stat3 AS-ON轉(zhuǎn)染Hep-2細胞24后，流式細胞檢測p-Stat3、HIF-1a、VEGF蛋白表達下降，與對照組相比有顯著意義。 5.流式細胞技術(shù)檢測低氧條件下Stat3 AS-ON聯(lián)合化療組細胞周期出現(xiàn)明顯G0/G1期阻滯，S期、G2/M期細胞比例減小。Stat3 AS-ON組也出

8、現(xiàn)G0/G1細胞阻滯。 6.200nmol/L Stat3 AS-ON轉(zhuǎn)染Hep-2細胞24h后，3μg/ml順鉑作用于低氧條件6h，流式細胞檢測p-Stat3、HIF-1a、VEGF表達下降，對比Stat3 S-ON轉(zhuǎn)染組、化療組、Stat3 S-ON轉(zhuǎn)染+化療組、空白對照、脂質(zhì)體對照組有顯著差異，細胞凋亡率增加，對比其余組別均有統(tǒng)計學差異。經(jīng)Pearson相關(guān)分析p-Stat3與HIF-1a、HIF-1a與VEGF、p-St

9、at3與VEGF表達及p-Stat3與凋亡率相關(guān)性有統(tǒng)計學意義，(相關(guān)系數(shù)r分別為0.884、0.667、0.783、-0.909)。 結(jié)論： 1.體外試驗控制細胞低氧生存環(huán)境可檢測到在較短時間即出現(xiàn)p-Stat3的表達增高，喉鱗癌細胞系Hep-2中存在由低氧激活的Stat3信號轉(zhuǎn)導。低氧誘導的HIF-1a表達在時效上晚于Stat3信號轉(zhuǎn)導，提示Stat3參與HIF-1a激活過程。 2.在模擬近似人體實體腫瘤的低

10、氧情況下，通過Stat3AS-ON轉(zhuǎn)染Hep-2細胞后，阻斷Stat3通路，可抑制腫瘤細胞增殖，阻斷Stat3信號通路激活，HIF-1a、VEGF亦出現(xiàn)明顯下降。說明Stat3通路是低氧誘導HIF-1激活所必須。在缺少Stat3激活的條件下VEGF激活受阻。 3.Stat3 AS-ON轉(zhuǎn)染可抑制Hep-2細胞活性，細胞存活率隨Stat3 AS-ON轉(zhuǎn)染濃度增加下降，但不能夠完全抑制腫瘤細胞的增殖，對細胞凋亡的誘導作用也有一定限度

11、，而且400nmol/L Stat3 S-ON由于高濃度寡核苷酸的非特異性毒性作用對細胞增殖亦表現(xiàn)一定抑制作用。可見寡核苷酸的低毒性、高特異性仍存在局限性。因此不能通過無限制的提高反義寡核苷酸的濃度來提高其殺傷腫瘤的作用。 4.低氧條件下順鉑誘導細胞凋亡較常氧降低。低氧條件可造成Hep-2細胞G0/G1期細胞周期阻滯，阻斷Stat3信號通路后細胞周期阻滯更為明顯。應(yīng)用Stat3反義寡核苷酸轉(zhuǎn)染Hep-2細胞在低氧條件下可不增加順