siRNA抑制Cyclophilin A基因?qū)眵[癌細(xì)胞Hep-2增殖、轉(zhuǎn)移及順鉑敏感性的作用.pdf

1、目的：喉癌是常見的頭頸部惡性腫瘤之一，其中喉鱗狀細(xì)胞癌（Laryngeal squamous cell carcinoma，LSCC）是其最主要的病理學(xué)類型，約占99％。LSCC的發(fā)病率最近幾年有所升高。因此探索對抗喉鱗癌轉(zhuǎn)移的新策略及藥物靶點是十分必要的。親環(huán)素A(Cyclophilin A，CypA)是免疫抑制劑環(huán)孢素A（CyclosporinA，CsA）的細(xì)胞內(nèi)結(jié)合蛋白。近來研究發(fā)現(xiàn)其在結(jié)腸癌、胰腺癌、肝癌等惡性腫瘤中高表達(dá)，并參

2、與腫瘤的發(fā)生發(fā)展及生物學(xué)行為。前期研究發(fā)現(xiàn)CypA在喉癌組織中的表達(dá)較正常癌旁組織明顯升高，但在喉癌中的生物學(xué)作用及機(jī)制尚不清楚。本實驗利用RNA干擾技術(shù)沉默Hep-2細(xì)胞中CypA的表達(dá)，檢測其對Hep-2細(xì)胞增殖、轉(zhuǎn)移等方面的影響及其可能的分子機(jī)制。
　　方法：將化學(xué)合成的靶向CypA的siRNA（small interfering RNA，小干擾RNA）轉(zhuǎn)染喉鱗癌細(xì)胞Hep-2，同時以轉(zhuǎn)染陰性對照NC siRNA和空白細(xì)胞作

3、為對照，3組細(xì)胞分別命名為control組、NC siRNA組、CypA siRNA組。運用real-time PCR檢測各組CypA及相關(guān)基因CD147、VEGF、MMP-9的mRNA表達(dá)差異；Western blot檢測CypA、CD147、MMP-9的蛋白表達(dá)變化；ELISA方法測定Hep-2細(xì)胞培養(yǎng)上清液中VEGF蛋白含量的變化；MTT法檢測CypA對細(xì)胞生長情況及順鉑敏感性的影響；平板克隆形成實驗觀察CypA在喉癌細(xì)胞增殖中的

4、作用；流式細(xì)胞術(shù)檢測CypA對細(xì)胞周期分布的影響；Transwell法檢測CypA在喉癌細(xì)胞侵襲、遷移中的作用；血管生成擬態(tài)(vasculogenic mimicry，VM)實驗檢測CypA對喉癌細(xì)胞血管通道形成能力的影響。
　　結(jié)果：CypA siRNA轉(zhuǎn)染后的Hep-2細(xì)胞中CypA mRNA和蛋白表達(dá)水平明顯降低（P=0.000）。沉默CypA的表達(dá)可下調(diào)CD147（P=0.000）、VEGF（P=0.001）、MMP-9（

5、P=0.000）的mRNA表達(dá)，同時可抑制Hep-2細(xì)胞VEGF的分泌和CD147、MMP-9蛋白的表達(dá)，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P=0.000）。MTT結(jié)果顯示CypA siRNA轉(zhuǎn)染后的Hep-2細(xì)胞生長緩慢，且對順鉑敏感性明顯增強(qiáng)（P=0.000）；細(xì)胞克隆形成被抑制，control組克隆數(shù)為（235.00±23.90）、NC siRNA組為（240.67±10.07）、CypA siRNA組為（129.33±14.22）（P=0.0

6、00）；細(xì)胞周期阻滯于G1期，各組增值指數(shù)分別為control組（0.337±0.016）、NC siRNA組（0.345±0.024）、CypA siRNA組（0.191±0.005）（P=0.000）；Hep-2細(xì)胞的遷移、侵襲能力明顯降低（P=0.000）。下調(diào)CypA表達(dá)后，Hep-2細(xì)胞 VM表達(dá)降低，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P=0.000）。
　　結(jié)論：CypA表達(dá)下調(diào)抑制喉癌細(xì)胞株Hep-2的增殖、遷移侵襲能力及VM表達(dá)