慢性乙型肝炎病毒感染合并非酒精性脂肪性肝病動物模型的建立和機制研究.pdf

1、目的：1)采用高脂飲食(HFD)喂飼乙型肝炎病毒(hepatitis B vires,HBV)轉(zhuǎn)基因小鼠,建立慢性HBV感染合并非酒精性脂肪性肝病(nonalcoholic fatty liver disease,NAFLD)的動物模型,并采用生化、分子生物學及組織病理學指標加以鑒定。2)探索HBV轉(zhuǎn)基因小鼠造模時間,揭示慢性HBV感染對高脂飲食誘導(dǎo)下NAFLD發(fā)生、病程及轉(zhuǎn)歸的影響及機制;同時研究TLRs/MyD88信號途徑與肝內(nèi)炎癥

2、的關(guān)系,以及IL-6等促炎細胞因子水平變化對肝臟炎癥反應(yīng)的影響。3)探討TLRs/MyD88信號途徑及IL-6等促炎細胞因子在HBV轉(zhuǎn)染合并肝細胞株脂肪變模型中的作用。
　　方法：1)將攜帶HBV全基因組的小鼠隨機分為雄性對照組、雄性NAFLD模型組、雌性對照組、雌性NAFLD模型組。各模型組給予高脂飲食(含膽固醇2％、豬油10％、基礎(chǔ)飼料88％),對照組則喂飼基礎(chǔ)飼料。分批于第8、16、24周末處死,檢測體質(zhì)指數(shù)、肝腎功能、糖脂

3、代謝等NAFLD相關(guān)指標二血清HBV分型、HBeAg、HBV-DNA,以及肝組織HBsAg免疫組化染色等病毒學指標;并通過HE、Mason及油紅O染色評價肝臟組織病理學的改變。2)檢測各組小鼠肝組織中TLR4,MyD88和IL-6 tuRNA及蛋白質(zhì)表達水平,分析其變化與肝臟免疫學指標、IR標志物以及肝臟病理學改變之間的相關(guān)性。3)建立細胞模型,以不同濃度硬脂酸作為脂肪變性的誘導(dǎo)劑,觀察HepG2.2.15細胞脂變的情況。檢測HBV-D

4、NA表達水平和TLR4,MyD88和IL-6 mRNA表達水平。
　　結(jié)果：1)與對照組相比,不同造模時間的雌性和雄性NAFLD模型組小鼠體重、肝重、肝指數(shù)均顯著增高;ALT、AST、ALP、γ-GT、總膽紅素(TBIL)、膽汁酸(TBA)等肝功能指標受損:總膽固醇(TC)、甘油三酯(TG)、高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)、低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)、空腹血糖(FBG)等糖脂代謝指標也有不同程度升高。各模型組小鼠的血清HB

5、V-DNA、HBeAg水平呈下降趨勢,肝細胞HBsAg陽性率無明顯差異。組織病理學檢查提示,造模第8周時雌、雄模型組小鼠均可見不同程度的肝細胞脂肪變,伴小葉內(nèi)散在的點狀壞死及炎癥細胞浸潤;第24周時肝臟脂肪變及炎癥雖未明顯加重,但有竇周纖維化和中央靜脈周圍纖維化。2)血清HBV-DNA和HBeAg,HBsAg的檢測顯示,肝細胞脂肪變乃至NAFLD的發(fā)生都不增加HBV轉(zhuǎn)基因小鼠血清及肝臟的病毒學指標。雌性NAFLD模型組炎癥、壞死、纖維化

6、等肝組織病理學變化較輕,NAS評分在8、16、24等各時間點均顯著低于相應(yīng)的雄性NAFLD模型組。3)TLR-4/MyD88途徑及其下游產(chǎn)物在高脂飲食的HBV感染的小鼠中表達增高。TLR-4和MyD88在mRNA水平隨著肝脂肪變性的嚴重程度而顯著上調(diào)。免疫組化結(jié)果顯示,NAFLLD+HBV組的TLR-4和MyD88的染色強度明顯高于HBV對照組和正常對照組。在NAFLLD+HBV組中的IL-6的活性也明顯高于對照組。4)HepG2.2.

7、15細胞脂肪變性模型顯示,硬脂酸處理組和正常對照的HBV-DNA水平未見統(tǒng)計學差異。同時,經(jīng)過硬脂酸刺激的HepG2.2.15細胞在48小時后TLR-4和MyD88的表達量明顯增加。TLR-4/MyD88的下游產(chǎn)物IL-6的表達在硬脂酸處理組有明顯上調(diào)。
　　結(jié)論：成功建立慢性HBV感染合并NAFLD動物模型,為進一步研究慢性乙型肝炎合并NAFLD發(fā)病機制、藥物篩選及療效評價等提供了可靠的實驗平臺。雌激素可能在雌性NAFLD模型組