神經(jīng)生長因子對山羊骨髓間充質干細胞增殖及向成骨分化的調節(jié)作用.pdf

1、目的：體外培養(yǎng)山羊骨髓間充質干細胞（BMSCs）并向成骨方向進行誘導，通過加入神經(jīng)生長因子（NGF），研究NGF在成骨培養(yǎng)基中對山羊BMSCs增殖及分化的影響。為闡明NGF促進牽張成骨術（DO）中骨形成的機理提供實驗依據(jù)，希望所建立的實驗方法能為將來進一步的臨床和科研工作建立穩(wěn)定的細胞模型，從而使牽張成骨術中促進牽張區(qū)新骨生成，解決臨床問題提供一種可能。
　　 方法：抽取山羊骨髓，利用Percoll分離液進行密度梯度離心結合貼壁

2、法分離山羊BMSCs，體外培養(yǎng)擴增，觀察其形態(tài)學變化。體外培養(yǎng)至第三代后，首先用流式細胞儀檢測細胞表面標志物，以鑒定細胞純度，排除了雜質細胞的干擾；再將第三代BMSCs分為A、B、C、D四組，A組(空白對照組)：用含10％胎牛血清的低糖DMEM常規(guī)培養(yǎng)液培養(yǎng)。B組(成骨誘導對照組):成骨誘導液為常規(guī)培養(yǎng)液中加入10-8mol/L地塞米松、50mg/L維生素C、10mmol/Lβ-甘油磷酸鈉。C組(NGF組)：常規(guī)培養(yǎng)液中加入終濃度為10

3、0ng/ml的NGF。D組(實驗組)：成骨誘導液中加入終濃度為100ng/ml的NGF。于第3,5,7天利用MTT法測定各培養(yǎng)組細胞增殖活性，第14天檢測各組細胞堿性磷酸酶(ALP)活性和骨鈣素（OC）水平、第21天應用Von Kossa染色的方法檢測鈣結節(jié)的形成，比較各組細胞成骨性能，觀察NGF對山羊BMSCs增殖及向成骨分化的影響。
　　 結果：⑴利用Percoll分離液進行密度梯度離心結合貼壁法分離、純化山羊BMSCs，是

4、一種簡便可行的方法，可獲得較高的純度，流式細胞術測得CD90、CD105為強陽性表達，CD34、CD45為陰性。⑵MTT法檢測細胞增殖實驗中，A組和C組細胞增殖率相似，B組和D組細胞增殖率相似，但B、D兩組明顯低于A、C兩組，差異有顯著性意義（p<0.05）。⑶各組細胞成骨性能檢測結果：A組和C組ALP和OC表達均無明顯差異（p>0.05），B組和D組ALP和OC表達明顯高于A組和C組，且D組較B組表達水平增高，差異有顯著性意義（p<0

5、.05）。A、C兩組細胞Von Kossa染色陰性，未見明顯的鈣化結節(jié)出現(xiàn)；B組細胞Von Kossa染色陽性，可見黑色鈣化結節(jié)，D組較成骨誘導對照組鈣化結節(jié)數(shù)目明顯增多，面積增大。
　　 結論：密度梯度離心結合貼壁法是分離、純化山羊BMSCs的簡便實用的方法，傳至第三代即可獲得較高的純度。單純使用NGF對山羊BMSCs并無明顯促進增殖及分化的作用，但NGF在山羊BMSCs向成骨細胞分化過程中具有明顯的促進作用。這為加快骨形成，