三黃膠囊對(duì)消除淋病奈瑟氏菌R質(zhì)粒的作用研究.pdf

1、目的：細(xì)菌質(zhì)粒包括F因子、R因子、Col因子、Ti因子、巨大質(zhì)粒和降解性質(zhì)粒等。其中R因子又稱為R質(zhì)粒，R質(zhì)粒上攜帶著耐藥基因，賦予了細(xì)菌對(duì)某些抗生素的耐藥性。近30年來，國內(nèi)外的一些研究者積極尋找一種有效的方法去消除耐藥質(zhì)粒，以逆轉(zhuǎn)細(xì)菌耐藥。淋病是我國目前最常見的性傳播疾病之一，隨著抗生素的廣泛使用，淋病耐瑟氏菌的耐藥性也越來越嚴(yán)重。大量研究發(fā)現(xiàn)淋病奈瑟氏菌的耐藥主要是由質(zhì)粒介導(dǎo)。國內(nèi)有用清熱解毒類中藥對(duì)G-桿菌進(jìn)行質(zhì)粒消除的研究，這

2、類中藥正好是中醫(yī)治療淋病的方劑，我們可以推測中醫(yī)治療淋病的基礎(chǔ)與質(zhì)粒消除有一定的聯(lián)系。本實(shí)驗(yàn)擬在研究三黃膠囊是否對(duì)淋病奈瑟氏菌R質(zhì)粒有消除作用，以及隨著三黃膠囊作用時(shí)間的延長能否增強(qiáng)其消質(zhì)效果。 方法：①淋病奈瑟氏菌質(zhì)粒提取：選用10株2008年在四川省皮膚性病研究所門診病員分離經(jīng)氧化酶試驗(yàn)及糖發(fā)酵試驗(yàn)鑒定的淋病奈瑟氏菌，先將其在10個(gè)無選擇的T-M培養(yǎng)基上復(fù)蘇，24小時(shí)后將其轉(zhuǎn)種于新的10個(gè)T-M培養(yǎng)基，待24小時(shí)后再用接種環(huán)

3、分別刮取10個(gè)培養(yǎng)基上的淋病奈瑟氏菌于10個(gè)盛有1ml生理鹽水的Ep管中并標(biāo)明編號(hào)，用加樣槍輕輕吹打菌液使其混勻。將Ep管中的菌液按照AxyPrep質(zhì)粒提取盒說明書的步驟提取質(zhì)粒，提取完畢后將10株淋病奈瑟氏菌的質(zhì)粒提取液分別加入溴酚藍(lán)染色，用加樣槍將染色后的質(zhì)粒提取液及DNAmarker（300bp-10000bp）加入已備好的2%瓊脂糖凝膠樣孔中100v電泳40min，而后在紫外透視光下觀察質(zhì)粒條帶并做好記錄。②三黃膠囊亞抑菌濃度的

4、測定：將上述10株淋病奈瑟氏菌株復(fù)蘇轉(zhuǎn)種后用接種環(huán)分別刮取少許菌株于10個(gè)盛有1ml生理鹽水的玻璃試管中將其混勻，并將其置于光密度儀中，調(diào)整菌量和生理鹽水量使其光密度為0.3，從而制備好了菌液濃度為105/ml的淋病奈瑟氏菌液。將菌液用接種器接種在含不同量（6．25ul、12．5ul、25ul、50ul、100ul、200ul）三黃膠囊混懸液的T-M培養(yǎng)基上（每個(gè)培養(yǎng)皿的培養(yǎng)基的量為15ml），24h后觀察其生長情況，從而確定其亞抑菌濃

5、度，進(jìn)而制備含亞抑菌濃度三黃膠囊混懸液的T-M培養(yǎng)基。③淋病奈瑟氏菌質(zhì)粒消除實(shí)驗(yàn)：將上述10株淋病奈瑟氏菌再次按同樣方法復(fù)蘇、轉(zhuǎn)種，于24h后再次轉(zhuǎn)種于含亞抑菌濃度三黃膠囊混懸液的T-M培養(yǎng)基中，分別作用24h、48h、72h后提取其質(zhì)粒電泳觀察質(zhì)粒帶的變化，每24h都轉(zhuǎn)種一次，具體操作如下：將轉(zhuǎn)種24h后的淋病奈瑟氏菌接種于含亞抑菌濃度三黃膠囊混懸液的T-M培養(yǎng)基中培養(yǎng)24小時(shí)按照第一次提取質(zhì)粒的方法提取其質(zhì)粒并電泳與消質(zhì)前電泳結(jié)果作

6、對(duì)比，此時(shí)將淋病奈瑟氏菌再次轉(zhuǎn)種于含三黃膠囊混懸液的T-M培養(yǎng)基中，24小時(shí)后按同樣方法提取其質(zhì)粒電泳與消質(zhì)前電泳結(jié)果作對(duì)比，此時(shí)將淋病奈瑟氏菌再次轉(zhuǎn)種于含三黃膠囊混懸液的T-M培養(yǎng)基中，24小時(shí)后提取質(zhì)粒電泳與消質(zhì)前結(jié)果對(duì)比。最后將經(jīng)三黃膠囊作用24h、48h、72h的三次電泳結(jié)果作對(duì)比。 結(jié)果：所有入選的淋病奈瑟氏菌均生長良好，并且未受到污染。⑴提取質(zhì)粒的概況：10株淋病耐瑟氏菌中9株可見較清晰的質(zhì)粒帶，其分子量均為7．4K

7、b即亞洲型PPNG株。⑵淋病耐瑟氏菌在含不同量（6．25ul、12．5ul、25ul、50ul、100ul、200ul）三黃膠囊混懸液的T-M培養(yǎng)基上（每個(gè)培養(yǎng)皿的培養(yǎng)基的量為15ml）培養(yǎng)24h后觀察到淋病奈瑟氏菌均能生長，因此將三黃膠囊的亞抑菌濃度（即能使淋病奈瑟氏菌生長的最高藥物濃度），確定為200ul/培養(yǎng)皿，此濃度的消質(zhì)液即為實(shí)驗(yàn)所用的消質(zhì)劑。⑶10株淋病奈瑟氏菌在含三黃膠囊成分的T-M培養(yǎng)基上分別生長24h、48h、72h，

8、分別提取三個(gè)時(shí)間點(diǎn)的淋病奈瑟氏菌的質(zhì)粒電泳后觀察其質(zhì)粒帶的情況（與消質(zhì)前相比較）：作用24h后質(zhì)粒條帶減少2條；48h后減少3條；72h后減少8條。經(jīng)卡方檢驗(yàn)消質(zhì)劑作用24h、48h的淋病奈瑟氏菌質(zhì)粒陰轉(zhuǎn)率與消質(zhì)前淋病奈瑟氏菌質(zhì)粒陰轉(zhuǎn)率沒有顯著差異性（P>0．05），消質(zhì)劑作用72h的淋病奈瑟氏菌質(zhì)粒陰轉(zhuǎn)率與消質(zhì)前淋病奈瑟氏菌質(zhì)粒陰轉(zhuǎn)率有顯著差異性（P<0．05）。經(jīng)卡方檢驗(yàn)24h、48h、72h三個(gè)時(shí)間點(diǎn)消質(zhì)率有顯著差異性（P<0．0