腦膜炎奈瑟氏菌莢膜抗原基因簇的研究和遺傳分型方法的建立.pdf

1、腦膜炎奈瑟氏菌(Neisseria meningitidis)是專性人類寄生的革蘭氏陰性致病菌，可以引起腦膜炎和敗血癥等，由于它的致畸率、致死率和發(fā)病率一直較高，所以這種細菌引起的傳染病一直是人類健康的巨大威脅。鑒于腦膜炎奈瑟氏菌的重要性，有必要對它進行比較深入的研究。腦膜炎奈瑟氏菌主要是通過空氣、飛沫和密切的接觸進行傳播，呼吸道首先接觸到這類細菌。在大約10％人的鼻腔中攜帶腦膜炎奈瑟氏菌并且不致病，一旦這種細菌有機會穿過血腦屏障進入血

2、液或者是腦脊液就會引發(fā)嚴重的傳染性疾病。
　　 腦膜炎奈瑟氏菌的細胞外覆蓋的莢膜是重要的毒力因子，根據(jù)腦膜炎奈瑟氏菌的莢膜成分和免疫反應性等特點，將腦膜炎奈瑟氏菌分為12個血清群，即A、B、C、Y、W135、29E、X、Z、H、I、K和L等血清群，而A、B、C、W135，X和Y血清群的菌株引起90％以上的感染，屬于常見的血清群，而其余的幾個血清群常被稱為稀有血清群，它們引起的只是零星的感染或者是處于攜帶狀態(tài)。關于常見血清群的報道

3、要比稀有血清群的多。A、B、C、29E、W135，X和Y血清群的菌株莢膜基因簇序列可以在GenBank數(shù)據(jù)庫中找到，而H、I、K、L和Z等血清群菌株的莢膜基因簇至今還沒有破譯，這對于針對莢膜的疫苗研發(fā)和針對防控的血清群的檢測以及進化研究造成嚴重的障礙，所以有必要破譯H、I、K、L和Z等血清群菌株的莢膜基因簇，分析它們莢膜基因簇內(nèi)的基因功能，特別是莢膜多糖的合成和轉(zhuǎn)運基因，它們的序列對于種和血清群的檢測十分必要。
　　 本研究的首

4、要任務利用鳥槍庫破譯了H、I、K、L和Z等血清群菌株的莢膜基因簇，分別得到了23，488、24，676、27，709、18，453和21，871 bp的序列，注釋出來與這些序列相對應的開放閱讀框分別是19、18、22、14和15。通過Clustal X的比對發(fā)現(xiàn)I和K血清群的莢膜基因簇序列一致性達到了99％，而它們的莢膜多糖成分所有不同，所以推測造成莢膜多糖成分不同的一個異構(gòu)酶基因應該位于莢膜基因簇之外。Glycerol-3-PO4是H

5、和Z血清群的莢膜多糖的共有成分，它們的基因種類和功能也有一定的相似性。在序列和基因種類比較的基礎上，本研究分析了腦膜炎奈瑟氏菌的莢膜基因簇的整體進化特點。
　　 本研究的第二個任務就是利用血清群特異性的基因和腦膜炎奈瑟氏菌的種特有基因，開發(fā)了能夠檢測所有12個血清群的多重PCR實驗，連續(xù)使用三個多重PCR可以區(qū)分全部的血清群，多重PCR實驗還可以把血清學上分不了群的菌株通過這種遺傳學的方法直接分群。在檢測中能夠快速有效地區(qū)分稀有

6、血清群和不可分群菌株的血清群類型。每個被檢測的腦膜炎奈瑟氏菌都應該得到三個擴增子，其中的一個擴增子是利用條帶大小不同來區(qū)分血清群，另外兩個條帶，即ctrA和porA都是鑒定種，排除親緣關系比較近的淋病奈瑟氏菌和嗜乳糖奈瑟氏菌。
　　 用于分群檢測的多重PCR實驗的性能要用準確性和靈敏度來驗證。97個已知血清群的臨床分離腦膜炎奈瑟氏菌株對多重PCR準確性進行檢驗，得到準確率為100％。46個未知血清群的臨床分離株作為多重PCR的雙

7、盲實驗標本。最后的多重PCR試驗的結(jié)果和血清學上的分群結(jié)果進行比對，結(jié)果是準確率達到了98％。
　　 經(jīng)過多次的重復試驗，最后確定了基因組DNA和在非培養(yǎng)條件下的模擬臨床腦脊液標本中菌株數(shù)量的靈敏度。本研究所有的血清群的基因組DNA的靈敏度是1ng/20μL，相當于～4x105個基因組數(shù)量。非培養(yǎng)模擬腦脊液標本的靈敏度是～3×105 CFU/ml，可以直接用于臨床腦脊液標本或者是菌株基因組DNA的分群檢測。
　　 大腸桿

8、菌(Escherichia.coli)為埃希氏菌屬(Escherichia)的代表菌種，屬于革蘭氏陰性細菌。在自然界分布很廣，是腸道的正常菌群，大多數(shù)不致病，屬于條件致病菌。大腸桿菌細胞外有三種形式的抗原，即菌體(O)、莢膜(K)和鞭毛(H)等抗原。由于菌體外的脂多糖的結(jié)構(gòu)類型很多，僅菌體抗原(O抗原)的種類就有180多個血清型。
　　 大腸桿菌在免疫力低下等情況可以引起腸道感染、粘膜感染和泌尿生殖道感染，還可以引起豬、牛和羊等

9、家畜的疾病。脂多糖是大腸桿菌細胞外的主要表面成分，對致病性有很重要的作用，它的組成由核心多糖、O-特異性多糖側(cè)鏈、類脂A三個部分共價連接而成。O-特異性多糖鏈又稱O抗原多糖側(cè)鏈，簡稱O抗原，具有多樣性、穩(wěn)定性和特異性的特點。負責O抗原合成的基因一般都是在細菌的染色體上成線性排列，大腸桿菌O抗原基因簇通常位于galF和gnd基因之間，少數(shù)例外。
　　 由于O抗原在細菌的致病性和進化的研究上有很重要的意義，本研究破譯了大腸桿菌O41

10、的O抗原基因簇，并測定了它的結(jié)構(gòu)。經(jīng)過序列分析發(fā)現(xiàn)，大腸桿菌O41的O抗原基因簇注釋出12個開放閱讀框，包括GDP-L-Fuc合成酶基因(gmd、fcl、gmm、manC和manB)、糖基轉(zhuǎn)移酶基因(wfcV、wfcW、wfcX、wfcY和wfcZ)和寡糖單位處理酶基因(wzy和wzx)，O抗原的合成屬于Wzy/Wzx依賴型。測定的多糖結(jié)構(gòu)式如下：
　　 通過和現(xiàn)有的多糖結(jié)構(gòu)的比較，確定大腸桿菌O41的O抗原的多糖結(jié)構(gòu)在細菌多糖