腦膜炎奈瑟氏菌莢膜抗原基因簇的研究和遺傳分型方法的建立.pdf

1、腦膜炎奈瑟氏菌(Neisseria meningitidis)是專性人類寄生的革蘭氏陰性致病菌，可以引起腦膜炎和敗血癥等，由于它的致畸率、致死率和發(fā)病率一直較高，所以這種細(xì)菌引起的傳染病一直是人類健康的巨大威脅。鑒于腦膜炎奈瑟氏菌的重要性，有必要對它進(jìn)行比較深入的研究。腦膜炎奈瑟氏菌主要是通過空氣、飛沫和密切的接觸進(jìn)行傳播，呼吸道首先接觸到這類細(xì)菌。在大約10％人的鼻腔中攜帶腦膜炎奈瑟氏菌并且不致病，一旦這種細(xì)菌有機(jī)會穿過血腦屏障進(jìn)入血

2、液或者是腦脊液就會引發(fā)嚴(yán)重的傳染性疾病。
　　 腦膜炎奈瑟氏菌的細(xì)胞外覆蓋的莢膜是重要的毒力因子，根據(jù)腦膜炎奈瑟氏菌的莢膜成分和免疫反應(yīng)性等特點(diǎn)，將腦膜炎奈瑟氏菌分為12個血清群，即A、B、C、Y、W135、29E、X、Z、H、I、K和L等血清群，而A、B、C、W135，X和Y血清群的菌株引起90％以上的感染，屬于常見的血清群，而其余的幾個血清群常被稱為稀有血清群，它們引起的只是零星的感染或者是處于攜帶狀態(tài)。關(guān)于常見血清群的報(bào)道

3、要比稀有血清群的多。A、B、C、29E、W135，X和Y血清群的菌株莢膜基因簇序列可以在GenBank數(shù)據(jù)庫中找到，而H、I、K、L和Z等血清群菌株的莢膜基因簇至今還沒有破譯，這對于針對莢膜的疫苗研發(fā)和針對防控的血清群的檢測以及進(jìn)化研究造成嚴(yán)重的障礙，所以有必要破譯H、I、K、L和Z等血清群菌株的莢膜基因簇，分析它們莢膜基因簇內(nèi)的基因功能，特別是莢膜多糖的合成和轉(zhuǎn)運(yùn)基因，它們的序列對于種和血清群的檢測十分必要。
　　 本研究的首

4、要任務(wù)利用鳥槍庫破譯了H、I、K、L和Z等血清群菌株的莢膜基因簇，分別得到了23，488、24，676、27，709、18，453和21，871 bp的序列，注釋出來與這些序列相對應(yīng)的開放閱讀框分別是19、18、22、14和15。通過Clustal X的比對發(fā)現(xiàn)I和K血清群的莢膜基因簇序列一致性達(dá)到了99％，而它們的莢膜多糖成分所有不同，所以推測造成莢膜多糖成分不同的一個異構(gòu)酶基因應(yīng)該位于莢膜基因簇之外。Glycerol-3-PO4是H

5、和Z血清群的莢膜多糖的共有成分，它們的基因種類和功能也有一定的相似性。在序列和基因種類比較的基礎(chǔ)上，本研究分析了腦膜炎奈瑟氏菌的莢膜基因簇的整體進(jìn)化特點(diǎn)。
　　 本研究的第二個任務(wù)就是利用血清群特異性的基因和腦膜炎奈瑟氏菌的種特有基因，開發(fā)了能夠檢測所有12個血清群的多重PCR實(shí)驗(yàn)，連續(xù)使用三個多重PCR可以區(qū)分全部的血清群，多重PCR實(shí)驗(yàn)還可以把血清學(xué)上分不了群的菌株通過這種遺傳學(xué)的方法直接分群。在檢測中能夠快速有效地區(qū)分稀有

6、血清群和不可分群菌株的血清群類型。每個被檢測的腦膜炎奈瑟氏菌都應(yīng)該得到三個擴(kuò)增子，其中的一個擴(kuò)增子是利用條帶大小不同來區(qū)分血清群，另外兩個條帶，即ctrA和porA都是鑒定種，排除親緣關(guān)系比較近的淋病奈瑟氏菌和嗜乳糖奈瑟氏菌。
　　 用于分群檢測的多重PCR實(shí)驗(yàn)的性能要用準(zhǔn)確性和靈敏度來驗(yàn)證。97個已知血清群的臨床分離腦膜炎奈瑟氏菌株對多重PCR準(zhǔn)確性進(jìn)行檢驗(yàn)，得到準(zhǔn)確率為100％。46個未知血清群的臨床分離株作為多重PCR的雙

7、盲實(shí)驗(yàn)標(biāo)本。最后的多重PCR試驗(yàn)的結(jié)果和血清學(xué)上的分群結(jié)果進(jìn)行比對，結(jié)果是準(zhǔn)確率達(dá)到了98％。
　　 經(jīng)過多次的重復(fù)試驗(yàn)，最后確定了基因組DNA和在非培養(yǎng)條件下的模擬臨床腦脊液標(biāo)本中菌株數(shù)量的靈敏度。本研究所有的血清群的基因組DNA的靈敏度是1ng/20μL，相當(dāng)于～4x105個基因組數(shù)量。非培養(yǎng)模擬腦脊液標(biāo)本的靈敏度是～3×105 CFU/ml，可以直接用于臨床腦脊液標(biāo)本或者是菌株基因組DNA的分群檢測。
　　 大腸桿

8、菌(Escherichia.coli)為埃希氏菌屬(Escherichia)的代表菌種，屬于革蘭氏陰性細(xì)菌。在自然界分布很廣，是腸道的正常菌群，大多數(shù)不致病，屬于條件致病菌。大腸桿菌細(xì)胞外有三種形式的抗原，即菌體(O)、莢膜(K)和鞭毛(H)等抗原。由于菌體外的脂多糖的結(jié)構(gòu)類型很多，僅菌體抗原(O抗原)的種類就有180多個血清型。
　　 大腸桿菌在免疫力低下等情況可以引起腸道感染、粘膜感染和泌尿生殖道感染，還可以引起豬、牛和羊等

9、家畜的疾病。脂多糖是大腸桿菌細(xì)胞外的主要表面成分，對致病性有很重要的作用，它的組成由核心多糖、O-特異性多糖側(cè)鏈、類脂A三個部分共價(jià)連接而成。O-特異性多糖鏈又稱O抗原多糖側(cè)鏈，簡稱O抗原，具有多樣性、穩(wěn)定性和特異性的特點(diǎn)。負(fù)責(zé)O抗原合成的基因一般都是在細(xì)菌的染色體上成線性排列，大腸桿菌O抗原基因簇通常位于galF和gnd基因之間，少數(shù)例外。
　　 由于O抗原在細(xì)菌的致病性和進(jìn)化的研究上有很重要的意義，本研究破譯了大腸桿菌O41

10、的O抗原基因簇，并測定了它的結(jié)構(gòu)。經(jīng)過序列分析發(fā)現(xiàn)，大腸桿菌O41的O抗原基因簇注釋出12個開放閱讀框，包括GDP-L-Fuc合成酶基因(gmd、fcl、gmm、manC和manB)、糖基轉(zhuǎn)移酶基因(wfcV、wfcW、wfcX、wfcY和wfcZ)和寡糖單位處理酶基因(wzy和wzx)，O抗原的合成屬于Wzy/Wzx依賴型。測定的多糖結(jié)構(gòu)式如下：
　　 通過和現(xiàn)有的多糖結(jié)構(gòu)的比較，確定大腸桿菌O41的O抗原的多糖結(jié)構(gòu)在細(xì)菌多糖