自噬及內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激在內(nèi)皮細(xì)胞管型形成中的作用.pdf

1、目的:初步篩選靶向DPC4的miRNA，并探討此miRNA對(duì)DPC4的轉(zhuǎn)錄后調(diào)控作用及分子機(jī)制。
　　方法:結(jié)合基因芯片結(jié)果，利用生物信息學(xué)方法篩選出可能靶向DPC4基因的miRNA; Real-time PCR檢測(cè)五種大腸癌細(xì)胞miRNA和DPC4基因的表達(dá)，westem-blot檢測(cè)DPC4蛋白表達(dá)情況，選擇miRNA/DPC4比值最大的細(xì)胞株作為后續(xù)轉(zhuǎn)染對(duì)象;分別合成針對(duì)miR-190的mlmics和inhibitor，瞬時(shí)

2、導(dǎo)入所選出的大腸癌細(xì)胞株中，采用real-time PCR和western-blot檢測(cè)DPC4的表達(dá):使用psiCHECKTM-2載體，分別合成含miR-190可能靶向位點(diǎn)的DPC4/SMAD43′UTR片段的野生型及突變型雙熒光光素酶報(bào)告基因，將mimics-190和陰性對(duì)照分別與兩種質(zhì)粒組合共轉(zhuǎn)染入工具細(xì)胞293T中，使用Promega檢測(cè)系統(tǒng)對(duì)轉(zhuǎn)染后細(xì)胞雙熒光素酶活性檢測(cè)，計(jì)算相對(duì)熒光素酶活性并進(jìn)行分析。
　　結(jié)果:使用預(yù)

3、測(cè)軟件TargetScan、microRNA.org和mIRecords，預(yù)測(cè)miR-190可能對(duì)DPC4mRNA3＇UTR有直接的調(diào)控作用;熒光定量PCR分析了miR-190和DPC4基因的在五種大腸癌細(xì)胞系的表達(dá)情況，選取了表達(dá)較穩(wěn)定的miR-190及miRNA/DPC4比值最大的大腸癌細(xì)胞株HT-29作為后續(xù)研究對(duì)象;使用real-time PCR和western-blot檢測(cè)mimics和inhibitors瞬時(shí)轉(zhuǎn)染后miR-1

4、90和DPC4的表達(dá)，結(jié)果顯示miR-190mimics和inhibitor成功導(dǎo)入細(xì)胞，并且與各自陰性對(duì)照組相比，mimics組細(xì)胞DPC4蛋白表達(dá)水平下降，inhibitor組上升，而RNA水平無(wú)明顯變化;雙熒光素酶活性檢測(cè)系統(tǒng)檢測(cè)轉(zhuǎn)染后細(xì)胞雙熒光素酶活性，發(fā)現(xiàn)與陰性對(duì)照相比，miR-190可抑制psiCHECK-2TMvector-3＇UTR的熒光素酶報(bào)告基因活性。
　　結(jié)論:
　　1.DPC4基因是miRNA-190