自噬和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激在小鼠皮層神經(jīng)元缺糖缺氧預(yù)適應(yīng)中的作用.pdf

1、目的：研究自噬激活在體外培養(yǎng)的小鼠皮層神經(jīng)元缺糖缺氧預(yù)適應(yīng)中的作用，探討神經(jīng)元缺糖缺氧預(yù)適應(yīng)模型中自噬與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激、熱休克蛋白HSP70之間的關(guān)系。
　　 方法：采用兩次OGD(oxygen glucose deprivation)法建立小鼠皮層神經(jīng)元體外缺糖缺氧預(yù)適應(yīng)模型：首次預(yù)缺糖缺氧(IPC)時(shí)間為30min，之后給予神經(jīng)元基礎(chǔ)培養(yǎng)液實(shí)現(xiàn)再灌，24h后再次行致死性O(shè)GD1h、3h、6h;在預(yù)缺糖缺氧時(shí)給予自噬抑制劑3-me

2、thyladenine(3-MA，5、10、20 mM)，通過LDH漏出率檢測3-MA對缺糖缺氧引起的神經(jīng)元損傷的影響，MDC法觀察神經(jīng)元自噬活性，免疫細(xì)胞化學(xué)法檢測LC3蛋白的表達(dá)。Western Blot法檢測自噬溶酶體途徑相關(guān)蛋白LC3、Beclin-1、P62蛋白，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)蛋白GRP78、CHOP、caspase-12及熱休克蛋白HSP70的表達(dá)。
　　 結(jié)果：Western Blot結(jié)果證實(shí)了IPC時(shí)LC3及Be

3、clin1的表達(dá)上調(diào)，LDH結(jié)果以及顯微鏡觀察顯示缺糖缺氧預(yù)適應(yīng)可誘導(dǎo)神經(jīng)保護(hù)作用；但3-MA(10mM)用于缺糖缺氧預(yù)適應(yīng)的過程中，則顯著加重了細(xì)胞的損傷，提示自噬抑制劑取消了缺糖缺氧預(yù)適應(yīng)誘導(dǎo)的神經(jīng)保護(hù)作用。MDC結(jié)果顯示IPC3h組(缺糖缺氧30min后再灌注3h)自噬顆粒明顯高于OGD3h組，IPC+OGD3h組高于OGD3h組，而3MA+IPC+OGD3h組自噬顆粒減少；Western Blot結(jié)果顯示IPC+OGD3h組，L

4、C3和Beclin1的表達(dá)升高（與OGD組相比，P＜0.01），3-MA(10mM)明顯降低了LC3和Beclin1的表達(dá)(與IPC+OGD3h組相比，P＜0.01)。同時(shí)IPC3h及IPC+OGD3h組，P62的表達(dá)降低(與OGD3h組相比，P＜0.05)，3-MA(10mM)明顯增強(qiáng)了P62的表達(dá)(與IPC+OGD3h組相比，P＜0.05)，提示3-MA阻斷缺糖缺氧預(yù)適應(yīng)的神經(jīng)保護(hù)作用與抑制自噬有關(guān)。免疫細(xì)胞化學(xué)結(jié)果顯示，IPC3h

5、及IPC+OGD3h組，LC3的表達(dá)均上調(diào)（與OGD3h組相比，P＜0.01），3-MA(10mM)明顯抑制LC3的表達(dá)（與IPC+OGD3h組相比，P＜0.01）。Western Blot結(jié)果顯示，IPC+OGD3h組，HSP70和GRP78的表達(dá)均上調(diào)(與OGD3h組相比，P＜0.01)，3-MA(10mM)明顯抑制HSP70和GRP78的表達(dá)(IPC+OGD3h組相比，P＜0.01)；IPC+OGD3h組，CHOP和caspase

6、-12的表達(dá)均下降（與OGD3h組相比，P＜0.01），3-MA(10mM)明顯增加CHOP和caspase-12的表達(dá)（IPC+OGD3h組相比，P＜0.01。提示缺糖缺氧預(yù)適應(yīng)產(chǎn)生的神經(jīng)保護(hù)作用與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激有關(guān)。
　　 結(jié)論：1．缺糖缺氧預(yù)適應(yīng)能誘導(dǎo)神經(jīng)元自噬激活。2．自噬抑制劑3-MA能阻斷缺糖缺氧預(yù)適應(yīng)對神經(jīng)元的保護(hù)作用，說明缺糖缺氧預(yù)適應(yīng)的神經(jīng)保護(hù)作用可能是通過自噬-溶酶體途徑實(shí)現(xiàn)的。3．缺糖缺氧預(yù)適應(yīng)能誘導(dǎo)ER應(yīng)激，