豬瘟病毒石門株E2基因在永生化豬血管內(nèi)皮細(xì)胞的表達(dá).pdf

1、豬瘟(Classical swine fever,CSF)是由豬瘟病毒(Classical swine fevervirus，CSFV)引起的豬的急性高度接觸性傳染病，嚴(yán)重危害著世界養(yǎng)豬業(yè)的發(fā)展，被世界動(dòng)物衛(wèi)生組織(OIE)列為法定必須報(bào)告的傳染病。CSFV為有囊膜的RNA病毒，病毒基因組僅有一個(gè)大的開(kāi)放閱讀框(ORF)，編碼E0(或Ems)、E1和E2 3種囊膜糖蛋白，其中E2基因是豬瘟病毒的主要保護(hù)性抗原，可以有效刺激機(jī)體產(chǎn)生中和抗

2、體，抵抗CSFV強(qiáng)毒株的攻擊。由于傳統(tǒng)弱毒活疫苗接種后無(wú)法在血清學(xué)診斷上與自然感染強(qiáng)毒株相區(qū)別，弱毒活苗還能通過(guò)母體胎盤的感染造成死胎、弱仔、先天性感染仔豬，導(dǎo)致免疫耐受，而基因工程疫苗的出現(xiàn)為這一問(wèn)題的解決提供了新的思路。因此，本試驗(yàn)選取E2基因在逆轉(zhuǎn)錄病毒的介導(dǎo)下轉(zhuǎn)染永生化豬臍血管內(nèi)皮細(xì)胞(swine umbilical vein endothelialcells，SUVECs)，并表達(dá)在該細(xì)胞膜上，初步構(gòu)建基因工程疫苗。且本試驗(yàn)所

3、選用的永生化豬臍血管內(nèi)皮細(xì)胞為一種生理狀態(tài)下的細(xì)胞系，不具有致瘤性，不存在生物安全方面的問(wèn)題，這在研究和開(kāi)發(fā)豬瘟基因工程細(xì)胞苗方面具有相當(dāng)大的潛力。本試驗(yàn)獲得了以下結(jié)果： 1.重組逆轉(zhuǎn)錄病毒載體pBABE-puro-E2的構(gòu)建。RT-PCR擴(kuò)增豬瘟病毒石門株E2基因，將其連接到重組逆轉(zhuǎn)錄病毒載體pBABE-puro中，經(jīng)PCR擴(kuò)增和酶切鑒定，證明E2基因成功插入重組逆轉(zhuǎn)錄病毒載體pBABE-puro中，重組載體構(gòu)建成功。聚乙二醇

4、法提取和純化質(zhì)粒，以備包裝假病毒用。 2.假病毒的包裝。構(gòu)建好的重組逆轉(zhuǎn)錄病毒載體pBABE-puro-E2與pVSV-G質(zhì)粒經(jīng)磷酸鈣共轉(zhuǎn)染法，轉(zhuǎn)入293GP細(xì)胞中包裝成逆轉(zhuǎn)錄病毒假病毒，36～48h后收取上清，分裝備用。 3.表達(dá)E2基因陽(yáng)性細(xì)胞的篩選和初步免疫試驗(yàn)。包裝好的假病毒轉(zhuǎn)入永生化豬臍血管內(nèi)皮細(xì)胞，嘌呤霉素篩選出陽(yáng)性細(xì)胞，對(duì)篩選出的陽(yáng)性細(xì)胞進(jìn)行流式細(xì)胞分析和分選；經(jīng)間接免疫熒光染色試驗(yàn)和RT-PCR鑒定，豬瘟