小鼠p27kip1的SUMO化修飾對(duì)睪丸支持細(xì)胞細(xì)胞周期的影響研究.pdf

1、哺乳動(dòng)物成年后睪丸支持細(xì)胞的數(shù)量決定了睪丸大小和日精子產(chǎn)量，每個(gè)睪丸支持細(xì)胞所能供養(yǎng)的生殖細(xì)胞數(shù)目是一定的。細(xì)胞周期蛋白激酶抑制蛋白1Bp27Kip1(p27)，是成熟睪丸支持細(xì)胞的一個(gè)標(biāo)志蛋白，p27主要通過(guò)與細(xì)胞周期蛋白激酶2（CDK2）結(jié)合影響其活性，而參與調(diào)控細(xì)胞周期進(jìn)程。SUMO化修飾可以影響蛋白質(zhì)的活性，穩(wěn)定性，蛋白質(zhì)之間的相互作用和亞細(xì)胞定位和蛋白質(zhì)的運(yùn)輸。本研究的主要目的是探索p27能否被SUMO化修飾，確定p27的SU

2、MO化修飾位點(diǎn)，并闡明p27的SUMO化修飾對(duì)睪丸支持細(xì)胞細(xì)胞細(xì)胞周期的影響。
　　實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)如下:
　　本課題首先用免疫組織化學(xué)和western blot的方法檢測(cè)p27在0天、4天、10天和42天小鼠睪丸中的定位和表達(dá)情況(Takuya Sato et al2011)。利用敏感型細(xì)胞、CHO-K1作為實(shí)驗(yàn)材料，通過(guò)轉(zhuǎn)染SUMO-1、UBC9、p27和p27點(diǎn)突變載體，探討p27的SUMO化修飾模式，篩選p27的SUMO化修

3、飾位點(diǎn)以及SUMO化修飾對(duì)p27穩(wěn)定性的影響。分離培養(yǎng)7天小鼠睪丸支持細(xì)胞，轉(zhuǎn)染p27和p27點(diǎn)突變載體，流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞周期。
　　實(shí)驗(yàn)結(jié)果:(1) p27在各個(gè)時(shí)期的睪丸中均有表達(dá)，而且存在磷酸化，泛素化和SUMO化等多種蛋白翻譯后修飾，p27在10天的小鼠睪丸中表達(dá)水平顯著高于其它時(shí)，主要定位于生殖細(xì)胞、部分支持細(xì)胞和間質(zhì)細(xì)胞的細(xì)胞核內(nèi)，而42天小鼠睪丸中主要定位于支持細(xì)胞的細(xì)胞核內(nèi);(2) p27可以被SUMO-1修飾，

4、修飾發(fā)生在Lys189和Lys190，需要Lys189和Lys190同時(shí)突變才能阻斷p27的SUMO-1修飾作用，并且SUMO-1修飾位點(diǎn)突變后p27的蛋白水平顯著下降（P＜0.05）;(3)睪丸支持細(xì)胞轉(zhuǎn)染p27后，細(xì)胞周期G1期顯著增加（P＜0.05），轉(zhuǎn)染p27K190R突變載體后細(xì)胞周期G1期顯著增加（P＜0.05），2種突變p27 K189R和p27 K189AK/190R質(zhì)粒轉(zhuǎn)染后對(duì)細(xì)胞周期沒(méi)有影響。
　　綜上所述，本