PRRSV nsp1β單克隆抗體制備及蛋白質(zhì)組學(xué)研究.pdf

1、1987年，在美國首次發(fā)現(xiàn)了豬繁殖與呼吸綜合征（PRRS），相繼在歐洲也出現(xiàn)此病，這給世界養(yǎng)豬業(yè)帶來巨大的經(jīng)濟(jì)損失。豬繁殖與呼吸綜合征是由豬繁殖與呼吸綜合征病毒(PRRSV)引起的一種豬的烈性傳染病。研究表明，包括PRRSV在內(nèi)的一些病毒具有抑制干擾素產(chǎn)生，逃避免疫監(jiān)控的特點(diǎn)，抑制Ⅰ型干擾素的產(chǎn)生很大程度上歸因于非結(jié)構(gòu)蛋白通過阻斷IRF3入核，從而對(duì)IFN-β啟動(dòng)子和NF-κB啟動(dòng)子起到抑制作用。PRRSV nsp1β在調(diào)控宿主免疫反應(yīng)

2、中發(fā)揮重要作用，但具體的作用機(jī)制尚不明確。鑒于對(duì)nsp1β已有的研究，我們從蛋白質(zhì)組學(xué)的角度著手挖掘nsp1β的生物學(xué)功能。在本研究中成功制備了PRRSV nsp1β單克隆抗體，并成功包裝了表達(dá)nsp1β的重組慢病毒，利用iTRAQ結(jié)合LC-MS/MS蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)鑒定到感染PRRSV nsp1β慢病毒的豬肺泡巨噬細(xì)胞PAM3D4/21中有425個(gè)顯著差異表達(dá)的蛋白，這些蛋白在調(diào)控天然免疫、細(xì)胞凋亡等生物進(jìn)程中發(fā)揮著重要作用。主要研究內(nèi)

3、容如下:
　　1.PRRSV nsp1β的表達(dá)及純化
　　將PRRSV nsp1β成功連接到pGEX-6p-1載體上，利用原核表達(dá)系統(tǒng)在大腸桿菌BL21(DE3)中表達(dá)重組蛋白，通過摸索不同的誘導(dǎo)表達(dá)條件，最終確定最佳表達(dá)條件為37℃、0.8mM IPTG誘導(dǎo)5h，蛋白以不溶性包涵體的形式存在，經(jīng)純化后，獲得濃度為1.5mg/mL的純化蛋白。
　　2.PRRSV nsp1β單克隆抗體的制備
　　將純化后的nsp1

4、β蛋白作為免疫原，免疫六周齡雌性BALB/C小鼠，經(jīng)過細(xì)胞融合、ELISA篩選及細(xì)胞克隆，共獲得3株能穩(wěn)定分泌抗體的細(xì)胞株，分別命名為1G7、2A8、4G10，通過IFA及Western Blot實(shí)驗(yàn)對(duì)這3株細(xì)胞株的特異性進(jìn)行驗(yàn)證，結(jié)果顯示這3株單抗均能與PRRSV nsp1β發(fā)生特異性反應(yīng);同時(shí)也進(jìn)行了小鼠單克隆抗體亞型的鑒定，3株單抗的重鏈均為IgG1型、輕鏈均為κ鏈。
　　3.PRRSV nsp1β重組慢病毒質(zhì)粒的包裝

5、>　　在本研究中利用四質(zhì)粒的慢病毒包裝系統(tǒng)，將PLP1、PLP2、VSVG與慢病毒表達(dá)載體CMV-MCS-3flag-EF1-copGFP-T2A-Puro共轉(zhuǎn)染于HEK-293T細(xì)胞。PRRSVnsp1β基因利用慢病毒系統(tǒng)整合到宿主細(xì)胞基因組中，并利用IFA實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證了nsp1β的表達(dá)。
　　4.PRRSV nsp1β蛋白質(zhì)組學(xué)數(shù)據(jù)分析
　　為了進(jìn)一步研究nsp1β的所發(fā)揮的作用，本研究從蛋白質(zhì)組學(xué)的角度來研究PRRSV n

6、sp1β的生物學(xué)功能。本研究采用高通量定量蛋白組學(xué)方法——iTRAQ技術(shù)定量檢測在超表達(dá)PRRSV nsp1β的PAM3D4/21細(xì)胞中宿主蛋白差異表達(dá)的情況，共鑒定到425個(gè)差異表達(dá)的細(xì)胞蛋白，包括上調(diào)186個(gè)和下調(diào)239個(gè)蛋白質(zhì)。利用生物信息學(xué)分析了差異蛋白的亞細(xì)胞定位、參與的生物功能和蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)。本研究中所鑒定的這些差異蛋白涉及到細(xì)胞能量代謝、蛋白質(zhì)表達(dá)、細(xì)胞凋亡、免疫調(diào)節(jié)等相關(guān)的功能，使PRRSV nsp1β可以幫助PRR