表達西尼羅病毒囊膜糖蛋白prM-E重組新城疫病毒的構建及其免疫原性研究.pdf

1、西尼羅熱(West Nile Fever，WNF)是一種由西尼羅病毒(West Nile virus，WNV)引起的具有嚴重威脅的外來人畜共患病。人和動物在感染WNV后會出現發(fā)熱、腦膜炎、腦炎等癥狀，甚至引起死亡，因此該病毒在全球范圍內引起了廣泛的關注。西尼羅熱曾于2012年在美國爆發(fā)，引起了118人死亡，目前，我國未報道有WNF的臨床病例，但是我國自然地理環(huán)境復雜多樣，存在蚊蟲媒介繁殖和鳥類遷徙的天然條件，應提早引起重視，因此WNV在

2、我國出入境監(jiān)督防預系統(tǒng)中有重要的研究價值。
　　WNV屬于黃病毒科、黃病毒屬、日本腦炎血清群，是有囊膜的單股正鏈RNA病毒。WNV的結構蛋白包括C(capsid)蛋白、E(envelope)蛋白和M(membrane)蛋白。E蛋白是WNV表面最重要的結構蛋白，其表面的抗原決定簇與中和活性、組織嗜性、血清特異性、病毒的毒力、宿主范圍有關。新城疫病毒(Newcastle Disease virus，NDV)的低致病性毒株LaSota株

3、對哺乳動物不能產生有效感染，只在禽源組織中復制，并且具有外源蛋白表達效率高與生產成本低的優(yōu)點。以NDV為載體的重組疫苗其安全性和有效性在豬、犬、貓、非洲綠猴等多種動物得到證明。NDV活載體疫苗可以有效誘導機體產生粘膜、體液及細胞免疫反應。
　　目前，我國雖沒有WNV感染的病例報道，但鑒于該病毒傳入我國的高風險以及對人類極強的感染力和致病力，安全有效的儲備性疫苗的研制開發(fā)顯得尤為重要。從近幾年的WNV感染流行情況來看，流行范圍正在趨

4、于全球化，而且發(fā)生神經癥狀的比例顯著增加，世界各國針對WNV研制的疫苗在實際應用中相繼出現了各種問題。本實驗室建立起的新城疫病毒反向遺傳學操作平臺，成功構建并獲得表達H5亞型禽流感病毒保護性HA蛋白的重組NDV、表達狂犬病毒囊膜糖蛋白的重組NDV、分別表達尼帕病毒G蛋白和F蛋白的重組NDV等，這些重組病毒的安全性和有效性已經在實驗動物和本體動物上獲得驗證，繼而表明NDV作為活病毒疫苗載體具有極大的優(yōu)勢，同樣也是對于構建新型疫苗防治人類和

5、哺乳動物疾病是非常有前景的載體。
　　本研究利用反向遺傳操作系統(tǒng)，將人工合成的WNVprM和E基因與新城疫病毒LaSota疫苗株毒重組，拯救得到表達WNV prM和E蛋白的重組病毒rLa-WNV-prM/E，并在6周齡雌性C57BL/6小鼠上對其安全性和免疫原性進行評價。RT-PCR、間接免疫熒光和激光共聚焦等試驗證明WNVprM和E基因能夠正確插入和表達;對雞胚、小鼠和雞的動物試驗結果表明重組病毒rLa-WNV-prM/E沒有增

6、強載體病毒NDV LaSota疫苗株對小鼠和雞的致病力，具有良好生物安全性;利用Elisa、蝕斑減少中和試驗和流式細胞術等技術檢測重組病毒rLa-WNV-prM/E接種C57BL/6小鼠后誘導其產生的顯著的特異性IgG、中和抗體、CD4+及CD8+T淋巴細胞反應，說明rLa-WNV-prM/E能夠誘導機體產生高水平的抗WNV prM/E的特異性體液免疫和特異性細胞免疫反應。本研究表明重組病毒rLa-WNV-prM/E作為防控WNV的儲備