表達(dá)Flt3L的重組狂犬病病毒的構(gòu)建及其免疫原性的研究.pdf

1、狂犬病是由狂犬病病毒（Rabies virus，RABV）引起的以中樞神經(jīng)系統(tǒng)感染為特征的人畜共患傳染病，人和動(dòng)物一旦發(fā)病死亡率幾乎達(dá)100％(WHO2009)。全世界每年因狂犬病死亡的人數(shù)超過55000人，我國是狂犬病高發(fā)國家之一。目前狂犬病尚無特效的治療方法或藥物，疫苗的預(yù)防接種是該病防控的重要手段。
　　本研究通過反向遺傳操作技術(shù)在狂犬病病毒疫苗株LBNSE基因組中插入鼠源FMS樣酪氨酸激酶3配體(Fms-like tyro

2、sine kinase3ligand，F(xiàn)lt3L)基因，構(gòu)建了重組狂犬病病毒LBNSE-Flt3L。ELISA檢測(cè)結(jié)果表明重組狂犬病病毒LBNSE-Flt3L可在感染的BSR細(xì)胞表達(dá)Flt3L且具有劑量依賴性。LBNSE-Flt3L在體外生長曲線與親本毒株幾乎一致，表明外源基因Flt3L的表達(dá)對(duì)病毒的復(fù)制與擴(kuò)散沒有影響。腦部攻毒實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)小鼠并無發(fā)病癥狀，其體重呈先下降后上升的趨勢(shì)，較親本毒株LBNSE對(duì)小鼠致病性減弱，但差異不顯著。

3、r>　　為進(jìn)一步研究LBNSE-Flt3L的免疫原性，將重組狂犬病病毒免疫小鼠，與親本病毒LBNSE進(jìn)行比較，并將實(shí)驗(yàn)室之前構(gòu)建的LBNSE-GM-CSF（Wen et a12011）作為陽性對(duì)照。在免疫后第1-10周每周采血檢測(cè)其體內(nèi)的中和抗體水平，發(fā)現(xiàn)LBNSE-Flt3L和LBNSE-GM-CSF誘導(dǎo)的抗體水平在第四周均達(dá)到最高值，與親本毒株LBNSE相比，LBNSE-Flt3L與LBNSE-GM-CSF相似，均能更快地誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)

4、生更高滴度的抗體。另外，在重組狂犬病病毒免疫后的第二周，對(duì)免疫小鼠進(jìn)行了攻毒實(shí)驗(yàn)，腦內(nèi)注射50LD50的CVS-24病毒，結(jié)果發(fā)現(xiàn)LBNSE-Flt3L的免疫保護(hù)率可達(dá)到80％，而LBNSE的免疫保護(hù)率則為45％。
　　為進(jìn)一步研究細(xì)胞因子Flt3L增強(qiáng)狂犬病病毒免疫原性的作用機(jī)制，我們分離了小鼠骨髓源樹突狀細(xì)胞(DC)，并感染LBNSE-Flt3L，利用流式細(xì)胞儀檢測(cè)了重組病毒LBNSE-Flt3L對(duì)樹突狀細(xì)胞(DC)的激活作用

5、;同時(shí)，還將LBNSE-Flt3L感染6周齡小鼠，同樣利用流式細(xì)胞術(shù)對(duì)其感染后DC的激活以及對(duì)生發(fā)中心(Germinal Center，GC)的B細(xì)胞的的促進(jìn)情況進(jìn)行分析。結(jié)果發(fā)現(xiàn)無論是體外還是體內(nèi)實(shí)驗(yàn)，與Mock組和親本毒株LBNSE相比，LBNSE-Flt3L均可以顯著激活DC，與LBNSE-GM-CSF效果相當(dāng)，并能促進(jìn)更多GCB細(xì)胞的生成。
　　總之，表達(dá)Flt3L的重組狂犬病病毒LBNSE-Flt3L可以通過激活DC和促