兔出血癥病毒結(jié)構(gòu)基因在重組腺病毒系統(tǒng)中的表達及其免疫原性.pdf

1、兔病毒性出血癥(RHD)是由兔病毒性出血癥病毒(RHDV)引起的兔的傳染性疾病，病程短，死亡率高，可造成養(yǎng)兔業(yè)的巨大經(jīng)濟損失。VP60蛋白是RHDV唯一的結(jié)構(gòu)蛋白，在動物體內(nèi)可誘導(dǎo)產(chǎn)生中和抗體，與免疫反應(yīng)直接相關(guān)。目前廣泛使用的RHDV疫苗為組織滅活苗，雖然長期以來一直具有良好的免疫效果，但其自身具有不可避免的種種缺陷。由于兔病毒性出血癥病毒在體外組織細胞的培養(yǎng)方法尚未建立，所以近年來，人們對RHDV疫苗的研制主要著眼于基因工程苗的研制

2、，其既能起到免疫預(yù)防作用，又能很好的解決組織滅活苗的種種缺陷。因此，本研究利用RT-PCR技術(shù)把VP60基因克隆入腺病毒表達載體系統(tǒng)中，構(gòu)建成重組腺病毒，使VP60基因獲得表達，并研究其抗原性和免疫原性，以期為研究RHDV重組腺病毒疫苗奠定基礎(chǔ)。 本研究據(jù)GeneBank數(shù)據(jù)庫德國標準株的基因序列(M67473)，設(shè)計合成了一對針對VP60基因的特異性引物，在上游引物的5’端加入Kpn I酶切位點和起始密碼子，下游引物的5’端加

3、入Xho I酶切位點和終止密碼子。用RT-PCR技術(shù)從上海RHD兔的肝臟內(nèi)擴增出大小為1740bp的PCR產(chǎn)物，經(jīng)純化后與PMD19-T載體連接，轉(zhuǎn)化DH5α，然后在氨芐抗性(Amp+)平板上挑取陽性菌落，過夜培養(yǎng)，提取質(zhì)粒，經(jīng)Kpn I和Xho I雙酶切鑒定后進行DNA序列測定。用DNAStar軟件分析結(jié)果表明：擴增片斷與預(yù)期片斷大小相符，完全符合載體閱讀框。該株VP60基因序列(命名為SH-VP60)與國內(nèi)外其它分離株同源性為90.

4、2％～98.2％。將目的基因亞克隆至穿梭載體pShuttle-CMV，得到重組質(zhì)粒pShuttle-VP60，轉(zhuǎn)化到宿主菌E.coli DH5α中，提取陽性克隆質(zhì)粒，與骨架載體pAdEasy-1按一定比例混合，通過電轉(zhuǎn)化轉(zhuǎn)入E.coli BJ5183中，使它們在E．coli BJ5183中發(fā)生同源重組，從而使所克隆入穿梭載體內(nèi)的VP60基因進入腺病毒骨架載體。轉(zhuǎn)化后的E．coli BJ5183經(jīng)卡那霉素篩選得到陽性重組質(zhì)粒pAd-VP6

5、0。Pac I酶單酶切線性化后，在脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑介導(dǎo)下，轉(zhuǎn)染HEK293細胞，轉(zhuǎn)染后觀察細胞病變，當(dāng)出現(xiàn)明顯的細胞病變時，收獲病毒。經(jīng)IFA、SDS-PAGE和Western-blotting等鑒定，重組腺病毒VP60蛋白(約60KDa)在HEK293細胞中得到表達。 利用重組腺病毒表達的RHDV衣殼蛋白接種免疫2月齡以上非RHD免疫兔，結(jié)果顯示該表達的重組衣殼蛋白在免疫后22天可以誘導(dǎo)兔體產(chǎn)生抗RHDV抗體，其誘導(dǎo)的血凝抑制抗