橘黃色熒光蛋白在原核和真核生物中的表達.pdf

1、在過去的二十年里,桿狀病毒表達載體系統(tǒng)(baculovirus expression vector system,BEVS)被廣泛應用于重組蛋白的表達,并且已經(jīng)成功表達了大量的蛋白質(zhì)。該系統(tǒng)表達有著自己的優(yōu)勢,比如,在大腸桿菌中不能表達的真核生物蛋白,都能在BEVS中表達。而且該系統(tǒng)還可以在昆蟲細胞中對重組蛋白進行翻譯后的加工修飾,使表達的真核蛋白具有與天然產(chǎn)物幾乎相同的生物活性。最近,研究人員開發(fā)出了一種針對BmNPV的bacmid(

2、桿狀病毒穿梭載體)的表達系統(tǒng)。BmNPV bacmid可以像質(zhì)粒一樣在大腸桿菌Ecoli中復制,并保持其對昆蟲細胞的感染能力。由于這種技術(shù)大大縮短了病毒純化和擴增的周期,從而明顯減少了篩選病毒在技術(shù)上的困難和時間上的要求。由于操作是在bacterial和baculovirus之間進行,所以我們稱這一系統(tǒng)為Bac-to-Bac系統(tǒng)。
　　 Bac-to-Bac表達系統(tǒng)共分兩種,AcNPV和BmNPV。AcNPV主要以Spodopt

3、erafrugiperda和Trichoplusiani為宿主,而BmNPV只感染家蠶及其細胞系,宿主單一,具有良好的生物安全性。依托Bac-to-Bac系統(tǒng),重組供體質(zhì)粒pFastBacTM經(jīng)轉(zhuǎn)化進入宿主DH10BacTM E.coli,在helper plasmid編碼的轉(zhuǎn)座酶的幫助下,pFastBacTM上的元件mini-Tn7就會插入到bacmid上的mini-attTn7位點,發(fā)生轉(zhuǎn)座,生成重組Bacmid。重組蛋白在家蠶體內(nèi)

4、的表達水平比在其細胞系中要高出10-100倍,足以說明利用家蠶規(guī)?；a(chǎn)重組蛋白非常理想,是理想的真核蛋白生物反應器。
　　 新型橘黃色熒光蛋白OFF熒光能激發(fā)產(chǎn)生大量高強度的熒光,其熒光成熟快速而穩(wěn)定。作為一種生物技術(shù)工具,OFP應用非常廣泛,比如在目的基因的觀察、檢測以及活細胞中蛋白質(zhì)表達定量等各個方面。OFF強而穩(wěn)定,不需要依賴其他任何底物、輔助因子可激發(fā)出橘黃色熒光。另外,從光學角度來講,OFF不僅可以更好的穿透組織細胞

5、,而且能避免干擾活細胞自身存在的天然自動綠色熒光。
　　 本實驗先在大腸桿菌內(nèi)E.coli對OFF進行表達,證實OFF熒光強度高而穩(wěn)定,只需要UV激發(fā),無需添加任何酶或底物,適合被用作活細胞內(nèi)的分子標簽或蛋白質(zhì)融合伴侶。再通過給家蠶皮下直接接種重組bacmid DNA,在家蠶體內(nèi)高效表達了橘黃色熒光蛋白OFP。隨著DNA轉(zhuǎn)化為病毒,造成發(fā)病家蠶細胞的裂解,病毒隨之進入到血淋巴,我們就可以從發(fā)病蠶血淋巴中提取病毒。收集到的病毒就可