豬胰島素樣生長因子Ⅰ在原核與真核生物中的表達研究.pdf

1、胰島素樣生長因子Ⅰ(Insulin-like GrowthFactorI，IGF-I)是從血清中發(fā)現(xiàn)的一種多功能生長因子，可促進多種細胞的增殖、分化、生長。研究證實，IGF-I對動物繁殖及生長性能提高具有促進作用，同時對于多種疾病的治療及修復(fù)具有重要的作用。但IGF-I在血清中的含量很低，依靠純化天然的IGF-I根本無法滿足基礎(chǔ)研究及臨床應(yīng)用需求。 本試驗運用大腸桿菌原核表達系統(tǒng)及畢赤酵母真核表達系統(tǒng)分別進行豬IGF-I(plG

2、F-I)基因體外表達研究，針對不同的表達系統(tǒng)，通過PCR克隆及體外合成拼接分別獲得目的基因，并將pIGF-I基因分別克隆至原核表達載體pGEX-KG及真核表達載體pPIC9K中，進行表達研究，為利用IGF-I蛋白進行基礎(chǔ)研究及臨床應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。 1．構(gòu)建pIGF-I成熟蛋白的原核表達載體，表達plGF-I成熟蛋白與GST蛋白的融合蛋白。利用已經(jīng)構(gòu)建好的含有plGF-I全長cDNA的質(zhì)粒，設(shè)計含有合適酶切位點的引物，應(yīng)用PCR技術(shù)

3、擴增得到含有plGF-I信號肽與成熟蛋白序列的基因，將其克隆至原核表達載體pGEX-KG中，構(gòu)建了重組質(zhì)粒，經(jīng)PCR篩選、酶切鑒定和核苷酸序列測定，確定重組質(zhì)粒pKG-IGF-I構(gòu)建完全正確。將重組質(zhì)粒pKG-IGF-I轉(zhuǎn)化宿主菌BL21 (λDE3)，經(jīng)異丙基硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)誘導(dǎo)目的基因表達，SDS-PAGE電泳分析表明，重組菌可表達分子量約為37 kDa的重組蛋白。 2．重組菌進行大規(guī)模發(fā)酵，菌體經(jīng)超聲波破

4、碎，SDS-PAGE電泳分析表明，目的蛋白主要以可溶性形式存在于裂解液上清中。上清經(jīng)不同飽和度硫酸銨分級純化后，與佐劑混合免疫新西蘭大耳兔，于第三次加強免疫后，耳緣靜脈采血，瓊脂糖擴散實驗檢測抗體效價。從心臟采血分離的血清，經(jīng)ELISA檢測，抗體的效價達1:800。 3．采用酵母偏愛密碼子合成五條編碼plGF-I基因的引物，利用重疊PCR技術(shù)拼接獲得長度為210bp的豬IGF-I成熟蛋白基因。在基因兩端引入合適的酶切位點，將該基