基于同異源表達(dá)及缺失分析的青蒿ADS啟動(dòng)子研究.pdf

1、青蒿素(artemisinin)是從青蒿(Artemisia annua L.)中提取出的一種倍半萜內(nèi)酯,目前被廣泛應(yīng)用于瘧疾的治療。青蒿素在青蒿體內(nèi)的含量很低,為了滿足市場(chǎng)的需求,迫切需要提高青蒿體內(nèi)青蒿素的含量。青蒿素特異地在青蒿的油性腺毛中合成并貯存,腺毛特異性啟動(dòng)子對(duì)于青蒿素腺毛代謝工程具有重要的應(yīng)用價(jià)值。
　　青蒿紫穗槐二烯合成酶(Amorpha-4,11-diene Synthase, ADS)是青蒿素合成途徑的關(guān)系酶

2、,其在青蒿油性腺毛(不包括T字型腺毛)中特異表達(dá)。因此,能夠啟動(dòng) ADS基因轉(zhuǎn)錄的ADS啟動(dòng)子是否也具有腺毛特異性則有待研究。
　　本研究從青蒿中克隆了全長(zhǎng)2935 bp的ADS啟動(dòng)子,借助于GUS報(bào)告系統(tǒng),通過將該啟動(dòng)子在青蒿中進(jìn)行同源表達(dá)、在擬南芥(Arabidopsis thaliana)中進(jìn)行異源表達(dá)以及缺失分析后,得到以下研究結(jié)果及結(jié)論:
　　一、ADS啟動(dòng)子在青蒿及擬南芥中均具有腺毛特異性。
　　青蒿和擬南

3、芥的腺毛在結(jié)構(gòu)及功能上均有較大差別:青蒿的腺毛為多細(xì)胞油性腺毛,而擬南芥的為單細(xì)胞非油性腺毛。盡管如此, GUS染色結(jié)果表明,轉(zhuǎn)ADS啟動(dòng)子的青蒿及擬南芥中GUS染色均特異地局限于腺毛中,而在葉片的其他部位觀察不到任何染色。這一結(jié)果與ADS基因在青蒿的腺毛中特異表達(dá)這一現(xiàn)象吻合,同時(shí)說明 ADS啟動(dòng)子的腺毛特異性具有跨物種性。
　　二、ADS啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)上游-350 bp至-300 bp這一區(qū)段可能含有決定ADS啟動(dòng)子腺毛特

4、異性的關(guān)鍵元件。
　　ADS啟動(dòng)子全長(zhǎng)2935 bp,而將其從5’端缺失到轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)上游-350 bp處時(shí),缺失后片段在擬南芥中仍然保持著腺毛特異性;但當(dāng)繼續(xù)缺失到-300 bp時(shí),腺毛特異性消失,取而代之的是其下游報(bào)告基因在整個(gè)葉片中都有表達(dá)。由此可推測(cè),-350 bp至-300 bp這一區(qū)段可能含有決定ADS啟動(dòng)子腺毛特異性的關(guān)鍵順式作用元件。
　　三、與全長(zhǎng)ADS啟動(dòng)子相比,缺失ADS啟動(dòng)子片段的轉(zhuǎn)基因擬南芥腺毛特異

5、性表達(dá)植株率明顯降低。
　　本研究中,對(duì)于全長(zhǎng)ADS啟動(dòng)子或一個(gè)缺失ADS啟動(dòng)子片段,其轉(zhuǎn)基因擬南芥植株中呈現(xiàn)出腺毛特異性表達(dá)的植株數(shù)與所有陽性植株總數(shù)的比值為其轉(zhuǎn)基因擬南芥腺毛特異性表達(dá)植株率。研究發(fā)現(xiàn),與全長(zhǎng)ADS啟動(dòng)子相比,缺失 ADS啟動(dòng)子片段的轉(zhuǎn)基因擬南芥腺毛特異性表達(dá)植株率都有明顯的降低:全長(zhǎng)的植株率為70％左右,而缺失片段中Δ-800和Δ-550的僅有約1/5,其中植株率最高的Δ-400也僅有45.83%。這一結(jié)果表

6、明 ADS啟動(dòng)子腺毛特異性的背后有著未知且復(fù)雜的調(diào)控機(jī)制。
　　四、缺失ADS啟動(dòng)子片段的啟動(dòng)活性普遍高于全長(zhǎng)ADS啟動(dòng)子的啟動(dòng)活性。
　　通過對(duì)轉(zhuǎn)基因擬南芥進(jìn)行 GUS活性定量檢測(cè),研究發(fā)現(xiàn)Δ-800、Δ-600、Δ-550、Δ-500、Δ-450、Δ-400和Δ-350這7種腺毛特異性缺失ADS啟動(dòng)子片段轉(zhuǎn)基因擬南芥的GUS活性均顯著性高于全長(zhǎng) ADS啟動(dòng)子轉(zhuǎn)基因擬南芥的GUS活性,其中Δ-350的最高,為全長(zhǎng)ADS啟動(dòng)

7、子的3.27倍,而Δ-400的最低,為2.09倍;另外Δ-350轉(zhuǎn)基因擬南芥的GUS活性也顯著高于Δ-400的。這一結(jié)果說明ADS啟動(dòng)子-800 bp的上游可能存在負(fù)調(diào)控的區(qū)域,另外-400 bp至-350 bp之間也可能存在負(fù)調(diào)控區(qū)域。
　　本研究通過對(duì)ADS啟動(dòng)子的分析,得到一系列缺失ADS啟動(dòng)子片段,其中最短的僅417 bp(Δ-350)。這些片段的啟動(dòng)活性均高于全長(zhǎng)ADS啟動(dòng)子,但仍然保持著腺毛特異性,它們對(duì)于深入研究腺毛