人表皮細(xì)胞β1整合素啟動(dòng)子活性分析和鈣對(duì)β1整合素啟動(dòng)子活性及表達(dá)影響的研究.pdf

1、研究背景：
　　 皮膚表皮和附件是人體的保護(hù)屏障,防止脫水和外界微生物的侵害,為了抵御外界的物理損傷,皮膚經(jīng)歷持續(xù)的自我更新及創(chuàng)面修復(fù),以維持內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定。皮膚之所以能修復(fù)創(chuàng)傷并維持內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài),是因?yàn)閾p傷后具有修復(fù)表皮的表皮干細(xì)胞,表皮干細(xì)胞存在于人的毛囊,皮脂腺和表皮。表皮干細(xì)胞具有強(qiáng)大的增殖潛能,包括自我永生和產(chǎn)生分化的表皮細(xì)胞來構(gòu)成皮膚組織。近來科研工作者已經(jīng)揭開表皮干細(xì)胞具有強(qiáng)大的增殖和分化特性,并試圖解釋其為何具有如此

2、強(qiáng)大的增殖和分化潛能。
　　 β1整合素在表皮干細(xì)胞高表達(dá),被認(rèn)為是表皮干細(xì)胞的標(biāo)志物之一,大量研究表明,β1整合素在表皮干細(xì)胞增殖和分化中發(fā)揮著至關(guān)重要的作用。表皮干細(xì)胞主要存在表皮基底層及毛囊隆突部,β1整合素在此高表達(dá),表皮干細(xì)胞主要通過β1整合素與基底膜的粘附以及雙向跨膜信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)維持其干細(xì)胞特性,通過各種方法下調(diào)β1整合素后發(fā)現(xiàn),表皮干細(xì)胞走向終末分化。因此通過β1整合素的調(diào)控維持著皮膚的完整性和內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定。
　　

3、 鈣離子在表皮內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定中發(fā)揮著重要作用,在正常皮膚中存在著鈣離子梯度,在表皮基底層細(xì)胞鈣離子濃度較低,約0.5mmol/L而在表皮顆粒層鈣離子濃度明顯升高,約1.4mmol/L.大量文獻(xiàn)證實(shí)皮膚正常鈣離子梯度影響角質(zhì)化細(xì)胞增殖和分化。
　　 Piero C等利用MG-63細(xì)胞株(人骨肉瘤細(xì)胞株)研究證實(shí)β1整合素轉(zhuǎn)錄是由兩個(gè)獨(dú)立的啟動(dòng)子區(qū)調(diào)控,揭示了β1整合素轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)模式的復(fù)雜性,而整合素β1的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)即:高GC含量,缺少T

4、ATAbox和CCAAT box,存在多個(gè)GC-box,不同于管家基因的啟動(dòng)子區(qū)結(jié)構(gòu)特點(diǎn)。近端和遠(yuǎn)端啟動(dòng)子在正?；虼碳ひ蛩刈饔孟露寄艽龠M(jìn)轉(zhuǎn)錄。盡管作為轉(zhuǎn)錄起始的兩個(gè)獨(dú)立啟動(dòng)子促進(jìn)β1整合素基因表達(dá),產(chǎn)生兩種mRNA,但編碼序列卻沒變化,從而具有相同的編碼序列。然而β1整合素在表皮干細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄調(diào)控機(jī)制到目前為止尚不清楚。
　　 人表皮細(xì)胞株(Human adult skin keratinocytos,HaCaT)來源于正常成人皮

5、膚,是具有完整的表皮分化能力的永生化細(xì)胞株。研究表明,將HaCaT移植到裸鼠上,HaCaT可以形成分化上皮組織,表達(dá)特異性分化蛋白標(biāo)志,因此HaCaT可以作為研究人表皮細(xì)胞分化調(diào)控的理想模型。
　　 研究目的：
　　 本研究應(yīng)用β1整合素啟動(dòng)子熒光素酶報(bào)告基因系統(tǒng),以HaCaT細(xì)胞為模型,確定表皮細(xì)胞中β1整合素啟動(dòng)子的高轉(zhuǎn)錄活性區(qū)域,為進(jìn)一步研究調(diào)節(jié)表皮干細(xì)胞增殖與分化的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制奠定基礎(chǔ)。
　　 研究方法：

6、
　　 1.利用本實(shí)驗(yàn)室前期構(gòu)建的整合素β1啟動(dòng)子全長(zhǎng)、遠(yuǎn)端和近端及遠(yuǎn)端系列截短載體轉(zhuǎn)染HaCaT細(xì)胞,檢測(cè)它們?cè)贖aCaT中的相對(duì)熒光素酶活性,確定β1整合素啟動(dòng)子中的高活性啟動(dòng)序列范圍及進(jìn)行鈣處理后研究其對(duì)β1整合素啟動(dòng)子活性和表達(dá)的影響。
　　 2.進(jìn)行電泳遷移率分析(EMSA)確定并結(jié)合蛋白組學(xué)方法確定調(diào)節(jié)β1整合素啟動(dòng)子可能的高轉(zhuǎn)錄活性位點(diǎn)及參與轉(zhuǎn)錄調(diào)控的轉(zhuǎn)錄因子。
　　 研究結(jié)果：
　　 1.

7、β1整合素啟動(dòng)子在表皮細(xì)胞高轉(zhuǎn)錄活性區(qū)域位于遠(yuǎn)端啟動(dòng)子區(qū)的-352bp～-212bp之間。
　　 2.經(jīng)電泳遷移率分析證明在β1整合素遠(yuǎn)端啟動(dòng)子區(qū)-352bp～-212bp之間存在特異性轉(zhuǎn)錄因子與其結(jié)合,結(jié)合蛋白組學(xué)方法及轉(zhuǎn)錄因子預(yù)測(cè)系統(tǒng)表明,Sp1和MAZ可能協(xié)同調(diào)節(jié)β1整合素的啟動(dòng)子活性。
　　 3.鈣影響β1整合素啟動(dòng)子活性和β1整合素表達(dá)。鈣影響表皮細(xì)胞遷移可能通過β1整合素。
　　 研究結(jié)論：