缺血再灌注大鼠模型的病理變化及干細胞移植實驗效果研究.pdf

1、目的:
　　探索SD大鼠腦缺血2小時/再灌注模型超急性期、急性期及部分恢復(fù)期的病理動態(tài)變化,明確不同時期神經(jīng)細胞死亡/凋亡、小膠質(zhì)細胞、血腦屏障、炎癥因子及細胞間黏附分子變化的特點。探索移植骨髓間充質(zhì)干細胞(BMSCs)對大鼠中動脈栓塞(MCAO)模型大鼠的療效及其可能的作用機理。
　　方法:
　　1、線栓法建立MACO腦缺血2小時/再灌注模型,行神經(jīng)功能評分、體重及TTC染色梗死體積的測量,評估模型穩(wěn)定性。
　

2、　2、根據(jù)隨機數(shù)字表將SD大鼠分成正常對照組(每組4只)、假手術(shù)組(每組4只)和模型組(每組4只),模型組又分為0小時、0.5小時、1小時、2小時、4小時、6小時、12小時、24小時、48小時、4天、6天、10天、14天、18天共14個時程。對造模后大鼠進行神經(jīng)功能評分,只有評估為中度損傷的大鼠才能進入下一步實驗。采用HE染色及電鏡觀察腦組織梗死區(qū)和缺血半暗帶區(qū)神經(jīng)細胞的壞死和凋亡變化,評估神經(jīng)細胞死亡和凋亡的時間。
　　3、根據(jù)

3、隨機數(shù)字表將SD大鼠分成正常對照組(每組12只)、假手術(shù)組(每組12只)和模型組(每組6只),模型組又分為0小時、0.5小時、1小時、2小時、4小時、6小時、12小時、24小時、48小時、4天、6天、10天、14天、18天共14個時程。伊文思藍染色檢測來評估血腦屏障通透性的變化。Iba-1免疫組化檢驗?zāi)X組織梗死區(qū)和缺血半暗帶區(qū)小膠質(zhì)細胞變化。取大鼠血漿,酶聯(lián)免疫吸附法檢測血漿中炎癥因子TNFα、IL-1β和ICAM-1的表達。
　

4、　4、分離培養(yǎng)、純化和擴增BMSCs(直接貼壁法);流式細胞儀鑒定BMSCs表面抗原CD29、CD90、CD106、CD34、CD45、CD11b;腺病毒-增強綠色熒光蛋白(Ad-EGFP)標(biāo)記示蹤BMSCs,并明確其MOI值;
　　5、經(jīng)尾靜脈移植3×106 BMSCs治療MCAO建模后第12小時、4天、10天的大鼠;建模前后及處死前分別采用改良神經(jīng)功能損傷評分(mNSS)、粘附實驗和體重評估大鼠的神經(jīng)功能和體能恢復(fù)情況;建模后

5、第7天處死大鼠,取腦組織做酶聯(lián)免疫吸附試驗檢測大鼠腦組織IL-1β、IL-10、BDNF及VEGF表達。
　　結(jié)果:
　　1、線栓法阻斷大鼠大腦中動脈血流,造成其供血區(qū)域的腦梗死并產(chǎn)生神經(jīng)功能障礙。正常對照組和假手術(shù)組大鼠神經(jīng)功能評分均為0分,模型組大鼠再灌注后神經(jīng)功能術(shù)后平均為7.6±0.93分。術(shù)前體重平均為273±18.8g,術(shù)后體重平均為244±50.2g;模型組腦梗死體積百分比為31.40±3.36％。模型復(fù)制成功

6、,操作簡單,穩(wěn)定性及重復(fù)性好。
　　2、HE染色示神經(jīng)細胞壞死的形態(tài)學(xué)變化出現(xiàn)在腦缺血再灌注后12小時, MCAO術(shù)后24小時出現(xiàn)壞死區(qū)腦組織神經(jīng)細胞的崩解,細胞結(jié)構(gòu)消失。
　　3、MCAO術(shù)后4小時組電鏡可見到早期凋亡的過程變化(細胞變小、染色質(zhì)凝集)。凋亡的中期特征性變化可在24小時至4天組出現(xiàn)。晚期凋亡出現(xiàn)在MCAO術(shù)后6天組。
　　4、與假手術(shù)組及正常對照組比較,MCAO術(shù)后2小時組TUNEL-陽性細胞明顯增加

7、(P<0.05),最高值峰出現(xiàn)在MCAO術(shù)后4天組。MCAO術(shù)后6天組與假手術(shù)組及正常對照組相比,TUNEL陽性細胞無明顯增加(P>0.05)。
　　5、與假手術(shù)組及正常對照組相比,Iba-1陽性細胞于MCAO術(shù)后12小時組明顯增加(P<0.05),其峰值出現(xiàn)在MCAO術(shù)后10天組。MCAO術(shù)后18天組與假手術(shù)組及正常對照組相比,Iba-1陽性細胞表達仍有明顯增加(P<0.001)。
　　6、與假手術(shù)組及正常對照組相比,MC

8、AO術(shù)后2小時組伊文思藍含量明顯增加(P<0.05),其峰值出現(xiàn)MCAO術(shù)后24小時組。至MCAO術(shù)后18天組與假手術(shù)組及正常對照組相比,伊文思藍含量無明顯變化(P>0.05)。
　　7、MCAO術(shù)后2小時組與假手術(shù)組及正常對照組相比,ICAM-1的濃度有明顯增加(P<0.01),其峰值濃度出現(xiàn)在MCAO術(shù)后24小時組。MCAO術(shù)后18天組ICAM-1濃度與手術(shù)組及正常對照組相比,無明顯變化(P>0.05)。另外,本研究發(fā)現(xiàn)MCA

9、O術(shù)后不同時間點ICAM-1的濃度變化與腦組織伊文思藍含量的變化相一致。MCAO術(shù)后半小時組TNF-α濃度與假手術(shù)組及正常對照組相比,有明顯增加(P<0.05),其峰值濃度分別出現(xiàn)在MCAO術(shù)后4小時組及10天組。MCAO術(shù)后1小時組IL-1β濃度與假手術(shù)組及正常對照組相比,有顯著統(tǒng)計學(xué)差異(P<0.05)。IL-1β的峰值濃度分別出現(xiàn)在MCAO術(shù)后6小時組及10天組。
　　8、BMSCs高表達CD29(90.8%)、CD90(9

10、2.0%),中表達CD106(62.5%),低表達CD11b(21.9%)、CD34(0.7%)、CD45(13.3%)。加入MOI為100的Ad-EGFP孵育24h后BMSCs標(biāo)記率達80.2±4.9%。8、與PBS組相比,BMSCs移植4天組神經(jīng)功能評分有明顯改善(P<0.05),體重恢復(fù)也有明顯差異(P<0.05)。BMSCs移植12小時、4天和10天組IL-1β濃度逐漸下降(P<0.05)。BMSCs移植12小時、4天和10天組

11、IL-10濃度逐漸增加(P<0.05)。BMSCs移植12小時、4天和10天組VEGF和BDNF濃度無明顯變化(P>0.05)。
　　結(jié)論:
　　大鼠腦缺血再灌注后4小時內(nèi),可定義為超早期。大鼠腦缺血再灌注后6小時至24小時,可定義為急性期。大鼠腦缺血再灌注后24小時至48小時,可定義壞死期。大鼠腦缺血再灌注后4天至10天,可定義軟化期。大鼠腦缺血再灌注后10天以后,可定義為恢復(fù)期。TNF-α和IL-1β在大鼠腦缺血模型超急

12、性期、急性期和恢復(fù)期起作用,TNF-α可能是炎癥的主要發(fā)起者。TNF-α后再出現(xiàn)IL-1β的表達增加,提示IL-1β可能是一個重要的促炎細胞因子,促進了炎癥的擴展。研究顯示ICAM-1在大鼠缺血再灌注模型超急性期、急性期、壞死期、軟化期和恢復(fù)期起了作用。ICAM-1的表達與血腦屏障功能破環(huán)呈時間正相關(guān)性,ICAM-1也許在血腦屏障破壞中發(fā)揮作用。小膠質(zhì)細胞在大鼠缺血再灌注模型超急性期、急性期、壞死期、軟化期和恢復(fù)期起了作用。小膠質(zhì)細胞可

13、能在腦組織神經(jīng)細胞的損傷和修復(fù)中發(fā)揮了雙重作用。TNF-α可能是IL-1β和ICAM-1表達上游的誘導(dǎo)因子。本實驗揭示神經(jīng)細胞死亡出現(xiàn)在腦缺血再灌注后12小時至24小時,而神經(jīng)細胞凋亡的峰值出現(xiàn)在腦缺血灌注后4天。BMSCs移植后出現(xiàn)IL-1β濃度逐漸下降,而IL-10濃度逐漸上升的變化。這些數(shù)據(jù)表明,BMSCs移植后可能通過IL-10來抑制炎癥因子如IL-1β等表達來起到神經(jīng)保護作用,而非通過增加VEGF和BDNF來發(fā)揮神經(jīng)保護作用。