大鼠腎缺血再灌注損傷模型中PrxV和CAT的表達變化.pdf

1、腎缺血再灌注損傷(Renal ischemia reperfusion injury, RIRI)是急性腎動脈阻斷或腎臟移植等臨床治療過程中常見的病理生理過程。它也是導致腎移植后功能恢復延遲或病人發(fā)生急性腎衰的的重要因素。當腎臟發(fā)生缺血再灌注時會產(chǎn)生大量的活性氧族(reac-tive oxygen species，ROS)，使腎臟處于高度氧化應激狀態(tài)，這也是缺血再灌注損傷的重要機制之一。ROS的重要成員之一為H2O2，它可以通過破壞細胞

2、內的蛋白質、DNA和脂類等生物大分子來影響細胞功能，進而引起細胞和組織死亡。
　　 Peroxiredoxin(Prx)蛋白是近幾年發(fā)現(xiàn)的一類過氧化物酶系，研究表明，它們具有清除ROS的作用。PrxV是其成員之一，它幾乎在所有組織中均有表達，其中腎臟表達最高。線粒體和過氧化物酶體是細胞產(chǎn)生H2O2的兩個主要部位，而PrxV在這兩個部位均大量表達，因此推測:PrxV在清除H2O2中可能發(fā)揮了重要作用。過氧化氫酶（Catalases

3、，CAT）主要存在于過氧化物酶體內，負責清除脂類代謝過程中產(chǎn)生的H2O2。當腎臟發(fā)生缺血再灌注損傷并處于高度氧化應激狀態(tài)時，PrxV和CAT的mRNA水平如何改變，尚未見報道。
　　 本研究通過采用無損傷動脈夾鉗夾腎動脈法建立大鼠腎缺血再灌注損傷模型，然后觀察腎內PrxV和CAT的mRNA水平變化，探討其在清除H2O2中的作用，為腎缺血再灌注損傷的防治提供一條新思路。
　　 目的:
　　 觀察PrxV和CAT在大

4、鼠腎臟缺血再灌注損傷模型腎內的mRNA表達變化，探討其在腎內抗氧化應激反應中的作用。
　　 方法:
　　 1、腎臟缺血再灌注損傷模型的制備及取材；
　　 雄性Wister大鼠12只，體重200±10 g，購于河北醫(yī)科大學實驗動物中心，隨機分為對照組（Control）和腎臟缺血再灌注損傷組(RIRI)每組各6只。用6％水合氯醛腹腔注射麻醉大鼠(5ml/kg)，參照余曉東等人的方法制備腎臟缺血再灌注損傷模型。RIRI

5、組大鼠開腹后暴露其雙側腎臟，先切除右腎，然后鈍性分離左腎動脈，在靠近腎門處用無創(chuàng)動脈夾夾閉左腎動脈，觀察腎臟由鮮紅色逐漸變?yōu)榘导t色。45 mins后松開動脈夾，恢復血液供應，肉眼可見腎動脈充盈，腎臟由暗紅色迅速變?yōu)轷r紅色，表明再灌注成功。對照組大鼠開腹后只切除右腎，分離左腎動脈，但不夾閉左腎動脈。24小時后收集血液，3000rpm離心10min，分離血清用于血清肌酐(Serum Creatinine，SCr)、血尿素氮（Blood Ur

6、ea Nitrogen，BUN）濃度測定;處死大鼠取腎，一部分置于液氮中用于CAT和PrxV的mRNA水平測定，一部分4％多聚甲醛中固定進行HE染色，觀察腎組織形態(tài)學改變。
　　 2、測定指標及方法：
　　 2.1、HE染色觀察大鼠腎臟的形態(tài)結構；
　　 腎組織經(jīng)常規(guī)脫水、透明，石蠟包埋后，切片厚約5μm，蘇木精伊紅染色，日本產(chǎn)Olympus光學顯微鏡下觀察腎組織的形態(tài)學變化并進行圖象分析。
　　 2.2

7、、血清SCr和BUN濃度測定；
　　 血清SCr濃度采用苦味酸法測定;血清BUN濃度采用酶偶聯(lián)速率法測定。
　　 2.3、大鼠腎組織PrxV和CAT mRNA水平測定；
　　 Trizol法提取腎組織總RNA。約3μg總RNA反轉錄成cDNA。以GAPDH為內參照，進行反轉錄聚合酶鏈反應(Reverse TranscriptionPolymemse Chain Reaction，RT-PCR)。分別以PrxV、C

8、AT的擴增產(chǎn)物與GAPDH灰度值之比表示目的基因的mRNA相對表達量。
　　 結果:
　　 1、大鼠腎組織的形態(tài)學改變；
　　 光學顯微鏡下可見正常組大鼠腎血管球、腎小囊、近曲、遠曲小管及集合管形態(tài)結構清晰規(guī)整。而RIRI組大鼠可見腎血管球萎縮，體積變小;腎小囊腔擴張;腎小管管腔明顯擴張，個別近曲小管上皮細胞水腫，胞漿疏松化;腎間質水腫，腎小管間隙擴大;集合管出現(xiàn)管腔擴張、上皮水腫等改變。
　　 2、血清

9、SCr和BUN的濃度；
　　 與對照組相比，RIRI組血清中SCr和BUN的濃度均明顯升高(P＜0.05)。
　　 3、腎組織PrxV、CAT的mRNA相對表達量；
　　 采用RT-PCR的方法測定大鼠腎組織內PrxV、CAT等抗氧化酶系的mRNA相對表達量。計算目的基因與內參照的比值得出其相對表達量并進行結果統(tǒng)計。分析表明:RIRI組大鼠腎組織PrxV、CAT的mRNA相對表達量均明顯高于Con組(P＜0.05

10、)。說明RIRI組大鼠腎組織內PrxV、CAT等抗氧化酶系表達升高。
　　 結論:
　　 1、切除右腎后在靠近腎門處用無創(chuàng)動脈夾夾閉左腎動脈可成功建立大鼠腎臟缺血再灌注損傷模型。
　　 2、血清SCr和BUN的濃度在大鼠腎臟缺血再灌注損傷模型恢復血供24小時后已明顯升高，提示此時腎功能已嚴重受損。
　　 3、PrxV和CAT在大鼠腎臟缺血再灌注損傷模型的基因表達水平均明顯增強，提示它們在缺血再灌注損傷過程