兩株新城疫病毒強(qiáng)毒致病性的比較研究.pdf

1、新城疫(Newcastle disease，ND)是危害世界養(yǎng)禽業(yè)的一種重要傳染性疾病，其病原為新城疫病毒(Newcastle disease virus，NDV)。根據(jù)遺傳進(jìn)化距離，NDV可分為ClassⅠ和ClassⅡ兩大分支，目前已知的ClassⅠ NDV自然分離株均為弱毒株。本實(shí)驗(yàn)室保存的一株無毒力鴨源ClassⅠ NDVDuck/JS/10(HQ008337)，將該株病毒經(jīng)氣囊連續(xù)傳代10次后得到了變異株JS10-A10。經(jīng)測

2、定該變異株的MDT、ICPI、IVPI等毒力指標(biāo)均符合強(qiáng)毒標(biāo)準(zhǔn)，其F蛋白裂解位點(diǎn)亦變?yōu)?12KRQKRF117。動(dòng)物試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，JS10-A10通過肌肉注射或靜脈注射途徑對雞的致死率均為100％，而通過滴鼻、點(diǎn)眼自然感染的途徑卻不能致死雞，這與已知的新城疫傳統(tǒng)強(qiáng)毒株的特性嚴(yán)重不符。為了解析該變異強(qiáng)毒株與傳統(tǒng)強(qiáng)毒株的致病性差異，我們選擇了NDV國際標(biāo)準(zhǔn)強(qiáng)毒株Herts/33與變異株JS10-A10分別從體內(nèi)、體外試驗(yàn)以及生物信息學(xué)分析對兩者

3、的致病力進(jìn)行了系統(tǒng)的分析和比較。
　　1.兩株新城疫病毒強(qiáng)毒細(xì)胞感染的比較試驗(yàn)
　　分別使用JS10-A10和Herts/33在體外感染DF-1和脾淋巴細(xì)胞，比較了這兩株強(qiáng)毒在細(xì)胞水平上的致病性。在不同時(shí)間點(diǎn)分別檢測兩株病毒感染細(xì)胞后上清的病毒滴度，結(jié)果表明，Herts/33的滴度要比JS10-A10稍高，但經(jīng)統(tǒng)計(jì)后無明顯差異。兩株病毒感染脾淋巴細(xì)胞后，分別在6h、12h、18h和24h收集細(xì)胞樣品，檢測細(xì)胞因子（IFNα、

4、IFNβ、IFNγ、IL-1β、IL-6和IL-18）的表達(dá)情況。結(jié)果表明，JS10-A10和Herts/33在不同時(shí)間點(diǎn)誘導(dǎo)脾淋巴細(xì)胞表達(dá)細(xì)胞因子的變化趨勢基本一致，在mRNA的轉(zhuǎn)錄水平上無顯著差異。同時(shí)，JS10-A10和Herts/33誘導(dǎo)DF-1細(xì)胞以及脾淋巴細(xì)胞產(chǎn)生的凋亡水平均無顯著差異。此外，兩株病毒引起的細(xì)胞病變程度也進(jìn)一步表明兩者在細(xì)胞水平的致病力相似。
　　2.兩株新城疫病毒強(qiáng)毒感染SPF雞的致病力差異分析

5、>　　JS10-A10和Herts/33分別通過滴鼻點(diǎn)眼和肌肉注射感染4周齡SPF雞，根據(jù)不同組織的病毒載量、病變程度、細(xì)胞因子表達(dá)量以及機(jī)體的排毒和抗體水平，比較兩株強(qiáng)毒株對雞致病力差異。JS10-A10滴鼻點(diǎn)眼感染組在第5天病毒滴度最高(103-104 ELD50)，但第7天開始病毒在組織的分布逐漸降低直至消失;而JS10-A10肌肉注射組和Herts/33感染組感染后病毒滴度不斷增加，直至雞死亡，且病毒量可達(dá)到106 ELD50。

6、JS10-A10和Herts/33通過滴鼻點(diǎn)眼途徑感染雞，取其脾、肺、腸、和氣管制作病理切片。結(jié)果表明，JS10-A10感染雞只有肺臟組織切片稍微出血，而Herts/33感染雞脾、肺、腸和氣管都有顯著病變，尤其肺臟大片出血。排毒結(jié)果顯示JS10-A10滴鼻點(diǎn)眼組在感染后第5天喉氣管、泄殖腔棉拭子病毒量最高，分別為101.8和101.6 TCID50;而經(jīng)同樣途徑攻毒的Herts/33在相同時(shí)間點(diǎn)的病毒量分別為103.5和103.9TCI

7、D50?？贵w水平檢測顯示JS10-A10滴鼻點(diǎn)眼組在第4天抗體中和效價(jià)為24.5，之后逐漸升高，在第12天達(dá)到27.96;Herts/33滴鼻點(diǎn)眼組在第3天出現(xiàn)抗體中和效價(jià)的峰值(22)，之后降低直至死亡。細(xì)胞因子表達(dá)量檢測顯示JS10-A10滴鼻點(diǎn)眼組能在短時(shí)間內(nèi)誘導(dǎo)較高水平的細(xì)胞因子，包括IFNα、IFNβ、IFNγ、IL-1β、IL-6、IL-18、Mx和PKR;而Herts/33滴鼻點(diǎn)眼組誘導(dǎo)的細(xì)胞因子表達(dá)水平顯著低于JS10-

8、A10，且表達(dá)量峰值出現(xiàn)的時(shí)間較晚。總之，JS10-A10通過滴鼻點(diǎn)眼能誘導(dǎo)機(jī)體在較早的時(shí)間產(chǎn)生高水平的細(xì)胞因子，以及較高水平的病毒中和抗體效價(jià)，有效的抑制了病毒在體內(nèi)組織的擴(kuò)散和復(fù)制，直至將病毒清除。
　　3.兩株新城疫病毒強(qiáng)毒生物信息學(xué)分析及初步驗(yàn)證
　　體內(nèi)試驗(yàn)表明，JS10-A10滴鼻點(diǎn)眼途徑感染雞，其臟器的病毒含量比較低，但誘導(dǎo)的細(xì)胞因子水平比較高。我們猜測:兩株強(qiáng)毒①F蛋白的差異導(dǎo)致病毒在體內(nèi)復(fù)制過程中毒力發(fā)生改

9、變;②HN蛋白的差異導(dǎo)致病毒與受體結(jié)合的能力不同;③V蛋白的差異導(dǎo)致病毒拮抗細(xì)胞因子（尤其干擾素）的能力不同。針對以上推測，我們應(yīng)用DNAStar、MEGA、Clustal等軟件以及在線工具ESPript3.x、SWISS-MODEL，比對了JS10-A10和Herts/33的F、HN、V蛋白的氨基酸序列和空間結(jié)構(gòu)，并繪制遺傳進(jìn)化樹，初步分析了兩株強(qiáng)毒株在遺傳信息學(xué)上的差異。結(jié)果表明，兩株病毒的F基因裂解位點(diǎn)均為強(qiáng)毒特征，JS10-A1

10、0 F蛋白第25位氨基酸不是半胱氨酸(C)，而是丙氨酸(A); Herts/33 HN蛋白第520位為堿性氨基酸R，而JS10-A10為S。此外JS10-A10 HN蛋白比Herts/33多14個(gè)氨基酸，這可能影響病毒與受體的結(jié)合能力;V蛋白氨基酸序列差異最大，而NDV的V蛋白具有拮抗干擾素的功能，這可能是導(dǎo)致兩株病毒誘導(dǎo)機(jī)體細(xì)胞因子（尤其干擾素）表達(dá)量差異的原因。通過遺傳信息學(xué)分析，本實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步探究了兩株病毒HN蛋白受體結(jié)合能力的差異