豬TTV1-ORF1和TTV2-ORF1基因的克隆、表達(dá)及生物信息學(xué)分析.pdf

1、Torque teno virus(TTV)是日本科學(xué)家 Nishizawa等在1997年運(yùn)用代表性差異分析（Representational difference analysis,RDA)技術(shù)從不明原因的輸血后肝炎患者血清中發(fā)現(xiàn)的一種新的環(huán)狀單鏈 DNA病毒，又名輸血傳播病毒、細(xì)環(huán)病毒。國(guó)內(nèi)外學(xué)者先后在世界各地進(jìn)行了不同動(dòng)物源的 TTV流行病學(xué)調(diào)查及病原學(xué)研究，發(fā)現(xiàn) TTV1和 TTV2是仔豬多系統(tǒng)衰竭綜合征的潛在致病病毒，ORF1

2、可能編碼該病毒的核衣殼蛋白。目前國(guó)內(nèi)外通常采用 PCR方法檢測(cè)該病毒，該方法雖具有準(zhǔn)確性高的優(yōu)點(diǎn)，但難以快速?gòu)V泛應(yīng)用于各養(yǎng)殖場(chǎng)。血清 ELISA的檢測(cè)方法可以快速批量進(jìn)行動(dòng)物疾病的流行病調(diào)查。因此，本研究通過(guò)巢式 PCR方法擴(kuò)增獲得豬 TTV1-ORF1和 TTV2-ORF1全長(zhǎng)基因，分別克隆至克隆載體pEASY-T1,驗(yàn)證正確后，利用生物信息學(xué)軟件及在線分析軟件對(duì)測(cè)序結(jié)果進(jìn)行生物信息學(xué)分析,將驗(yàn)證正確的豬 TTV1-ORF1-XJ和

3、TTV2-ORF1-XJ亞克隆至表達(dá)載體 pEASY-E1，使用工程菌菌株 Transetta(DE3)、菌株 BL21（DE），Trans1-T1 Phage Resistant化學(xué)感受態(tài)細(xì)胞進(jìn)行原核誘導(dǎo)表達(dá)。本研究為構(gòu)建豬 TTV重組蛋白間接 ELISA診斷方法奠定了基礎(chǔ)。
　　主要結(jié)果如下：
　　1、根據(jù) Genbank上已發(fā)表的豬 TTV1和 TTV2全長(zhǎng)基因序列分別設(shè)計(jì)兩對(duì)上下游引物，通過(guò)巢式 PCR方法擴(kuò)增到19

4、17bp、1878bp的 TTV1-ORF1-XJ、TTV2-ORF1-XJ目的片段，并將這兩個(gè) PCR產(chǎn)物分別插入克隆載體 pEASY-T1，測(cè)序并驗(yàn)證。
　　2、利用生物信息學(xué)軟件及在線分析網(wǎng)站對(duì)其理化性質(zhì)、功能結(jié)構(gòu)域及蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)、3D結(jié)構(gòu)等信息進(jìn)行了分析。結(jié)果表明 TTV1-ORF1-XJ翻譯得638個(gè)氨基酸，具有親水性，磷酸化位點(diǎn)主要分布于絲氨酸、蘇氨酸、酪氨酸，預(yù)測(cè)發(fā)現(xiàn)其 N端附近有大量精氨酸，翻譯得到的蛋白存在于細(xì)

5、胞膜內(nèi)外，未見(jiàn)信號(hào)肽序列，存在1個(gè)跨膜區(qū)以及31個(gè) B細(xì)胞線性抗原表位。氨基酸穩(wěn)定性分析預(yù)測(cè)該蛋白中間有一段不穩(wěn)定區(qū)域。TTV2- ORF1-XJ翻譯得到625個(gè)氨基酸。其他信息與 TTV1-ORF1-XJ預(yù)測(cè)結(jié)果相似。
　　3、將測(cè)序驗(yàn)證正確的豬 TTV1-ORF1-XJ和 TTV2-ORF1-XJ基因亞克隆至表達(dá)載體，轉(zhuǎn)入大腸桿菌 BL21（DE），和 Transetta(DE3)后轉(zhuǎn)入 Trans1-T1 Phage Res

6、istant化學(xué)感受態(tài)細(xì)胞，用 IPTG在37℃和28℃下，使用 IPTG濃度為0.01 mM/μL，0.02 mM/μL,0.05 mM/μL,0.1 mM/μL,0.2 mM/μL誘導(dǎo)表達(dá)6-8小時(shí)，經(jīng)SDS-PAGE和 Western Blot印跡分析，結(jié)果顯示，構(gòu)建的表達(dá)載體TTV1-ORF1-XJ-E1和 TTV2-ORF1-XJ-E1蛋白表達(dá)量極低，在不同條件下未見(jiàn)明顯變化，且 TTV2-ORF1-XJ-E1表達(dá)過(guò)程中具有蛋