SMA病人特異性iPSCs靶向基因修復.pdf

1、脊髓性肌肉萎縮(Spinal muscular atrophy, SMA)是指一類由于脊髓前角運動神經(jīng)元(Anterior horn cells of the spinal cord)缺失而導致的進行性骨骼肌無力和萎縮的一組神經(jīng)變性疾病。該疾病主要是由于運動神經(jīng)元存活(Survival motor neuron1，SMN1)基因缺失或突變造成運動神經(jīng)元蛋白的缺失或功能喪失所致。目前臨床上尚無有效的治療方法。人的SMN1基因在每條5號染色

2、體長臂1區(qū)3帶，SMN2與SMN1高度同源，二者在外顯子上僅存在兩個堿基的差別。SMN2存在于所有的SMA病人中。本研究聯(lián)合利用類轉(zhuǎn)錄激活效應因子核酸酶(transcription activator like effector nucleases，TALEN)技術(shù)對病人特異性的誘導性多潛能干細胞(induced pluripotent stem cells，iPSCs)的SMN2基因進行定點打靶，使SMN2基因定點誘變成類SMN1基因

3、，表達出完整的SMN蛋白，行使其功能，從而實現(xiàn)對SMA的自體化基因治療。
　　一、SMA病人特異性iPSCs的誘導
　　目的:利用SMA病人來源的尿液細胞誘導SMA病人特異性的iPS細胞
　　方法:利用逆轉(zhuǎn)錄病毒將四種轉(zhuǎn)錄因子Oct4，Sox2，c-Myc和Klf4導入SMA患者來源的尿液細胞中，在VPA的作用下，獲得SMA病人特異性的iPSCs。通過細胞形態(tài)學、核型分析、堿性磷酸酶染色、干細胞表面標志物檢測及體內(nèi)分化

4、實驗對其進行鑒定。
　　結(jié)果:(1)免疫熒光檢測顯示誘導產(chǎn)生的SMA-iPSCs干細胞表面標志物表達情況與正常ESCs一致，堿性磷酸酶染色呈陽性;
　　(2)對誘導后傳至P15代的SMA-iPSCs行核型檢測顯示誘導后細胞沒有發(fā)生染色體水平的突變，檢測結(jié)果同該病人外周血檢測結(jié)果一致。
　　結(jié)論:本研究成功將SMA病人來源的尿液細胞誘導為病人特異性的iPSCs，初步鑒定結(jié)果顯示該病人特異性的iPSCs具有干細胞特性。

5、r>　　二、SMA非病毒基因治療載體的構(gòu)建與打靶
　　目的:構(gòu)建定點誘變載體pMN-Neo，該載體定點靶向SMN2基因，聯(lián)合TALEN技術(shù)將pMN-Neo定點靶入SMA-iPSCs的SMN2基因7、8號外顯子區(qū)，篩選獲得表達SMN蛋白的克隆。
　　方法:1.通過PCR擴增，酶切，連接等分子技術(shù)構(gòu)建載體pMN，再在載體pMN中加入Neo篩選基因的完整表達框獲得載體pMN-Neo;
　　2.采用單細胞核轉(zhuǎn)染的方式轉(zhuǎn)染單細胞